Balita

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang mga pamamaraan ng enzymatic proximity labeling batay sa mga activated ester o phenoxy radical ay malawakang ginagamit upang i-map ang mga subcellular na proteome at mga interaksyon ng protina sa mga buhay na selula.Gayunpaman, ang mga aktibong ester ay hindi gaanong reaktibo, na nagreresulta sa isang malawak na radius ng pag-label, at ang mga radikal na phenoxy na nabuo sa pamamagitan ng paggamot sa peroxide ay maaaring makagambala sa mga redox pathway.Dito nag-uulat kami ng isang proximity labeling dependent photoactivation (PDPL) na pamamaraan na binuo sa pamamagitan ng genetically linking ng miniSOG photosensitizer protein sa isang protina ng interes.Na-trigger ng asul na liwanag at kinokontrol ng oras ng pagkakalantad, nabubuo ang singlet na oxygen at pagkatapos ay nakakamit ang spatiotemporally na naresolba na pag-label ng mga labi ng histidine ng aniline probe.Ipinakita namin ang mataas na katapatan nito sa pamamagitan ng pagmamapa ng proteome na partikular sa organelle.Ang isang side-by-side na paghahambing ng PDPL sa TurboID ay nagpapakita ng mas tiyak at komprehensibong proteomic na saklaw ng PDPL.Susunod, inilapat namin ang PDPL sa transcriptional coactivator na nauugnay sa sakit na BRD4 at E3 Parkin ligase at natagpuan ang mga dating hindi kilalang mga interaksyon.Sa pamamagitan ng overexpression screening, dalawang hindi kilalang substrate, Ssu72 at SNW1, ay nakilala para sa Parkin, na ang pagkasira ay pinagsama ng ubiquitination-proteasome pathway.
Ang tumpak na paglalarawan ng mga network ng protina ay sumasailalim sa maraming pangunahing proseso ng cellular.Samakatuwid, ang lubos na tumpak na spatiotemporal na pagmamapa ng mga pakikipag-ugnayan ng protina ay magbibigay ng isang molekular na batayan para sa pag-decipher ng mga biological na landas, patolohiya ng sakit, at pagkagambala sa mga pakikipag-ugnayan na ito para sa mga layuning pang-therapeutic.Sa layuning ito, ang mga pamamaraan na may kakayahang makita ang mga temporal na pakikipag-ugnayan sa mga buhay na selula o tisyu ay lubos na kanais-nais.Makasaysayang ginamit ang Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) upang matukoy ang mga nagbubuklod na kasosyo ng mga protina ng interes (POI).Sa pagbuo ng mga pamamaraan ng quantitative proteomics, nilikha ang Bioplex3.0, ang pinakamalaking database ng mga network ng protina batay sa AP-MS.Bagama't napakalakas ng AP-MS, ang cell lysis at dilution na mga hakbang sa daloy ng trabaho ay bias patungo sa mahina at lumilipas na mga pakikipag-ugnayan na nagbubuklod at nagpapakilala ng mga post-lysis artifact tulad ng mga pekeng pares ng pakikipag-ugnayan na kulang sa compartmentalization bago ang lysis.
Upang matugunan ang mga isyung ito, ang mga hindi natural na amino acid (UAA) na may mga crosslinking na grupo at enzymatic na malapit na labeling (PL) na mga platform (hal. APEX at BioID)5 ay binuo.Bagama't matagumpay na nailapat ang paraan ng UAA sa maraming sitwasyon at nagbibigay ng impormasyon tungkol sa mga direktang protina na pandikit, kailangan pa rin ang pag-optimize ng insertion site ng UAA.Higit sa lahat, ito ay isang stoichiometric na paraan ng pag-label na walang catalytic reversal ng mga kaganapan sa pag-label.Sa kabaligtaran, ang mga pamamaraan ng enzymatic PL, tulad ng pamamaraan ng BioID, ay nagsasama ng inhinyero na biotin ligase sa POI7, na kasunod na nagpapagana ng biotin upang bumuo ng isang reaktibong biotinyl-AMP ester intermediate.Ang enzyme ay nag-catalyze at naglalabas ng isang activated biotin na "cloud" na naglalagay ng label sa proximal lysine residues.Gayunpaman, ang BioID ay nangangailangan ng higit sa 12 oras upang makakuha ng sapat na may label na signal, na humahadlang sa paggamit nito sa temporal na resolusyon.Gamit ang nakadirekta na ebolusyon batay sa pagpapakita ng lebadura, ang TurboID ay idinisenyo batay sa BioID upang maging mas mahusay, na nagbibigay-daan sa mahusay na pag-label gamit ang biotin sa loob ng 10 minuto, na nagpapahintulot sa higit pang mga dynamic na proseso na pag-aralan.Dahil ang TurboID ay lubos na aktibo at ang mga endogenous na antas ng biotin ay sapat para sa mababang antas ng pag-label, ang background label ay nagiging isang potensyal na problema kapag ang mataas na pinahusay at napapanahon na pag-label ay kinakailangan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng exogenous biotin.Bilang karagdagan, ang mga aktibong ester ay hindi gaanong reaktibo (t1/2 ~5 min), na maaaring humantong sa isang malaking radius ng pag-label, lalo na pagkatapos ng saturation ng mga kalapit na protina na may biotin 5. Sa isa pang diskarte, ang genetic fusion ng engineered ascorbate peroxidase (ie biotin- phenol radicals at nagbibigay-daan sa pag-label ng protina sa loob ng isang minuto9,10. Ang APEX ay malawakang ginagamit upang matukoy ang mga subcellular proteome, membrane protein complex, at cytosolic signaling protein complex11,12. Gayunpaman, ang pangangailangan para sa mataas na konsentrasyon ng peroxide ay maaaring makaapekto sa redox proteins o pathways, na nakakagambala mga proseso ng cellular.
Kaya, ang isang bagong pamamaraan na may kakayahang makabuo ng mas reaktibo na may label na-radius suppression species na may mataas na spatial at temporal na katumpakan nang hindi makabuluhang nakakagambala sa mga cellular pathway ay magiging isang mahalagang karagdagan sa mga umiiral na pamamaraan. Kabilang sa mga reaktibong species, ang singlet oxygen ay pumukaw sa aming atensyon dahil sa maikling buhay nito at limitadong diffusion radius (t1/2 < 0.6 µs sa mga cell)13. Kabilang sa mga reaktibong species, ang singlet oxygen ay pumukaw sa aming atensyon dahil sa maikling buhay nito at limitadong diffusion radius (t1/2 < 0.6 µs sa mga cell)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограсниче и ограслород из-за его короткого времени жизни и ограгниче и ограгниче/6 мклоднод из-за его короткого времени жизни и ограгниче/6 мкодноченту Kabilang sa mga aktibong anyo, ang singlet na oxygen ay nakakuha ng aming pansin dahil sa maikling buhay nito at limitadong diffusion radius (t1/2 < 0.6 µs sa mga cell)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）走们我们我。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограница и ограница и ограница и ограница и ограница и ограни/2хифкого . Sa mga aktibong porma, ang singlet na oxygen ay umaakit sa ating atensyon dahil sa maikling buhay nito at limitadong diffusion radius (t1/2 <0.6 μs sa mga cell).Ang singlet oxygen ay naiulat na random na nag-oxidize ng methionine, tyrosine, histidine at tryptophan, na ginagawa itong polar 14,15 para sa attachment sa amine o thiol based probes16,17.Bagama't ginamit ang singlet na oxygen upang lagyan ng label ang subcellular compartment na RNA, ang mga diskarte para sa muling paggamit ng mga endogenous na POI proximity marker ay nananatiling hindi ginalugad.Dito, ipinakita namin ang isang platform na tinatawag na photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), kung saan gumagamit kami ng asul na ilaw upang maipaliwanag ang mga POI na sinamahan ng isang miniSOG photosensitizer at mag-trigger ng singlet oxygen generation upang i-oxidize ang proximal residues, na sinusundan ng mga pagbabago na naglalaman ng amine upang ma-oxidize ang mga chemical probes sa mga intermediate na buhay na selula..Sinubukan namin ang isang pangkat ng mga chemical probe para ma-maximize ang specificity ng tag at natukoy ang mga site ng pagbabago gamit ang isang open proteomics workflow.Ang isang side-by-side na paghahambing ng PDPL sa TurboID ay nagpapakita ng mas tiyak at komprehensibong proteomic na saklaw ng PDPL.Inilapat namin ang diskarteng ito sa mga organelle-specific na marker ng subcellular proteome at pangkalahatang proteome identification ng mga nagbubuklod na kasosyo para sa cancer-associated epigenetic regulatory protein BRD4 at ang Parkinson's disease-associated E3 ligase Parkin, na nakumpirma ang parehong kilala at hindi kilalang network ng protina. pakikipag-ugnayan..Ang kakayahan ng PDPL na makilala ang mga substrate ng E3 sa malalaking mga kumplikadong protina ay kumakatawan sa isang sitwasyon kung saan kinakailangan ang pagkilala sa mga hindi direktang binder.Dalawang hindi kilalang mga substrate ng parkin na pinagsama ng ubiquitination-proteasome ay nakumpirma sa situ.
Photodynamic therapy (PDT)19 at chromophore-assisted laser inactivation (CALI)20, kung saan ang light irradiation na may mga photosensitizer ay bumubuo ng singlet oxygen, ay maaaring mag-inactivate ng mga target na protina o maging sanhi ng pagkamatay ng cell.Dahil ang singlet oxygen ay isang highly reactive substance na may theoretical diffusion distance na humigit-kumulang 70 nm, maaaring kontrolin ang spatially limited oxidation sa paligid ng photosensitizer.Batay sa konseptong ito, nagpasya kaming gumamit ng singlet na oxygen upang makamit ang malapit na pag-label ng mga complex ng protina sa mga buhay na selula.Bumuo kami ng isang PDPL chemoproteomic na diskarte upang matupad ang apat na mga function: (1) upang ma-catalyze ang henerasyon ng aktibong singlet oxygen na katulad ng PL enzymatic approach;(2) magbigay ng time-resolved labeling sa magaan na pagsisimula;(3) sa pamamagitan ng pagbabago (4) Iwasan ang paggamit ng mga endogenous cofactor (gaya ng biotin) upang bawasan ang background, o gumamit ng lubhang nakakabagabag na mga exogenous reagents (tulad ng mga peroxide) upang mabawasan ang pagkakalantad ng cell sa stress sa kapaligiran.
Ang mga photosensitizer ay maaaring hatiin sa dalawang kategorya kabilang ang maliliit na molekular na timbang na fluorophores (eg rose bengal, methylene blue)22 at genetically encoded na maliliit na protina (eg miniSOG, KillerRed)23.Upang makamit ang isang modular na disenyo, binuo namin ang unang henerasyong platform ng PDPL sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga protina ng photosensitizer (PS) sa POI24, 25 (Larawan 1a).Kapag na-irradiated ng asul na liwanag, ang singlet na oxygen ay nag-oxidize ng proximal na nucleophilic amino acid residues, na nagreresulta sa isang umpolung polarity na electrophilic at maaaring higit pang tumugon sa amine probe nucleophiles16,17.Ang probe ay dinisenyo na may alkyne handle upang payagan ang click chemistry at hilahin pababa para sa LC/MS/MS characterization.
Ilustrasyon ng eskematiko ng pag-label ng mga kumplikadong protina na pinagsama ng miniSOG.Kapag nalantad sa asul na liwanag, ang mga cell na nagpapahayag ng miniSOG-POI ay bumubuo ng singlet na oxygen, na nagbabago sa mga nakikipag-ugnayang protina ngunit hindi sa mga hindi nagbubuklod na protina.Ang mga intermediate na produkto ng photooxidation ay naharang ng mga relay label ng amine chemical probe upang bumuo ng mga covalent adduct.Ang pangkat ng alkynyl sa chemistry probe ay nagbibigay-daan sa click chemistry para sa pagpapayaman sa pamamagitan ng pull-down na sinusundan ng LC-MS/MS quantitation.b Kemikal na istraktura ng amine probes 1-4.c Representative fluorescent gel analysis ng mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic marker gamit ang probes 1-4 at relative quantification batay sa gel densitometry.Ang signal-to-background ratio ng mga chemical probes ay nasuri gamit ang mga negatibong eksperimento sa kontrol na hindi kasama ang asul na ilaw o gamit ang HEK293T na mga cell na walang expression ng miniSOG.n = 2 biologically independent sample.Ang bawat tuldok ay kumakatawan sa isang biological replica.d Representative detection at quantification ng PDPL gamit ang optimized probe 3 sa presensya o kawalan ng mga ipinahiwatig na bahagi ng PDPL tulad ng c.n = 3 biologically independent sample.Ang bawat tuldok ay kumakatawan sa isang biological replica.Ang mga centerline at whisker ay kumakatawan sa mean at ± standard deviation.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal imaging ng singlet oxygen na may malayong pulang mantsa ng Si-DMA.Scale bar: 10 µm.Ang gel imaging at confocal na mga eksperimento ay nakapag-iisa na inulit ng hindi bababa sa dalawang beses na may katulad na mga resulta.
Una naming sinubukan ang kakayahan ng mga mature na photosensitizer na miniSOG26 at KillerRed23, na matatag na ipinahayag sa HEK293T, upang mamagitan ang pag-label ng propargylamine ng proteome bilang isang chemical probe (Karagdagang Fig. 1a).Ang pagsusuri sa fluorescence ng gel ay nagpakita na ang buong pag-label ng proteome ay nakamit gamit ang miniSOG at asul na pag-iilaw ng liwanag, habang walang nakikitang produkto ng pag-label ang naobserbahan sa KillerRed.Upang mapabuti ang ratio ng signal-to-background, sinubukan namin ang isang hanay ng mga chemical probes na naglalaman ng aniline (1 at 3), propylamine (2), o benzylamine (4).Napansin namin na ang HEK293T cells mismo ay may mas mataas na signal sa background kumpara sa walang asul na ilaw, posibleng dahil sa endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Ang mga kemikal na probes na batay sa aniline 1 at 3 ay nagbigay ng mas mahusay na pagtitiyak, na may HEK293T na matatag na nagpapahayag ng miniSOG sa mitochondria na nagpapakita ng >8-tiklop na pagtaas ng signal para sa probe 3, habang ang probe 2 na ginamit sa paraan ng pag-label ng RNA na CAP-seq ay nagpapakita lamang ng ~2.5- pagtaas ng signal ng fold, malamang dahil sa iba't ibang mga kagustuhan sa reaktibiti sa pagitan ng RNA at protina (Larawan 1b, c). Ang mga kemikal na probes na batay sa aniline 1 at 3 ay nagbigay ng mas mahusay na pagtitiyak, na may HEK293T na matatag na nagpapahayag ng miniSOG sa mitochondria na nagpapakita ng >8-tiklop na pagtaas ng signal para sa probe 3, habang ang probe 2 na ginamit sa paraan ng pag-label ng RNA na CAP-seq ay nagpapakita lamang ng ~2.5- pagtaas ng signal ng fold, malamang dahil sa iba't ibang mga kagustuhan sa reaktibiti sa pagitan ng RNA at protina (Larawan 1b, c).Ang mga kemikal na probes na batay sa aniline 1 at 3 ay nagpakita ng mas mahusay na pagtitiyak: HEK293T, na matatag na nagpapahayag ng miniSOG sa mitochondria, ay nagpapakita ng higit sa 8-tiklop na pagtaas ng signal para sa probe 3, habang ang probe 2, na ginagamit sa paraan ng pag-label ng CAP-seq RNA, lamang nagpapakita ng ~2.5-tiklop na pagtaas ng signal, marahil dahil sa iba't ibang mga kagustuhan sa reaktibiti sa pagitan ng RNA at protina (Larawan 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 用 于 于 rna 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 显示 显示 显示 显示 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加-倍信号增加，可能是由于RNAAng mga kemikal na probes na batay sa aniline 1 at 3 ay may mas mahusay na pagtitiyak, ang HEK293T ay matatag na nagpahayag ng miniSOG sa mitochondria, at ang probe 3 ay may higit sa 8-tiklop na pagtaas sa signal, habang ang probe 2 para sa pamamaraan ng pag-label ng CAP-seq RNA ay nagpakita lamang ng ~2.5 -tiklop na pagtaas.sa signal, marahil dahil sa iba't ibang mga kagustuhan sa reaksyon sa pagitan ng RNA at protina (Larawan 1b, c).Bilang karagdagan, ang probe 3 isomers at hydrazine probes (probes 5, 6, 7) ay nasubok, na nagpapatunay sa pag-optimize ng probe 3 (Karagdagang Fig. 1b, c).Katulad nito, ang in-gel fluorescence analysis ay nagsiwalat ng iba pang na-optimize na mga parameter ng eksperimentong: irradiation wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), at irradiation time (20 min) (Karagdagang Fig. 2a–c).Ang pag-alis ng anumang bahagi o hakbang sa PDPL protocol ay nagresulta sa makabuluhang pagbabalik ng signal sa background (Larawan 1d).Kapansin-pansin, ang pag-label ng protina ay makabuluhang nabawasan sa pagkakaroon ng sodium azide o trolox, na kilala upang pawiin ang singlet na oxygen.Ang pagkakaroon ng D2O, na kilala na nagpapatatag ng singlet oxygen, ay nagpapahusay sa signal ng label.Upang siyasatin ang kontribusyon ng iba pang mga reaktibong species ng oxygen sa pag-label, ang mannitol at bitamina C ay idinagdag upang magtatag ng hydroxyl at superoxide radical scavengers, ayon sa pagkakabanggit, 18, 29, ngunit hindi sila natagpuan upang mabawasan ang pag-label.Ang pagdaragdag ng H2O2, ngunit hindi pag-iilaw, ay hindi nagresulta sa pag-label (Karagdagang Fig. 3a).Kinumpirma ng fluorescence singlet oxygen imaging na may Si-DMA probes ang pagkakaroon ng singlet oxygen sa HEK293T-miniSOG wire, ngunit hindi sa orihinal na HEK293T wire.Bilang karagdagan, hindi ma-detect ng mitoSOX Red ang produksyon ng superoxide pagkatapos ng pag-iilaw (Larawan 1e at Karagdagang Fig. 3b) 30. Ang mga datos na ito ay mariing nagmumungkahi na ang singlet na oxygen ay ang pangunahing reaktibong species ng oxygen na responsable para sa kasunod na pag-label ng proteomic.Ang cytotoxicity ng PDPL ay nasuri kasama ang blue light irradiation at chemical probes, at walang makabuluhang cytotoxicity ang naobserbahan (Karagdagang Fig. 4a).
Upang pag-aralan ang mekanismo ng pag-label at paganahin ang proteomic na pagkakakilanlan ng mga complex ng protina gamit ang LC-MS/MS, kailangan muna nating matukoy kung aling mga amino acid ang binago at ang delta mass ng mga label ng probe.Ang methionine, histidine, tryptophan at tyrosine ay naiulat na binago ng singlet oxygen14,15.Isinasama namin ang TOP-ABPP31 workflow sa walang pinapanigan na bukas na paghahanap na ibinigay ng FragPipe computing platform batay sa MSFragger32.Pagkatapos ng singlet oxygen modification at chemical probe labeling, isinagawa ang click chemistry gamit ang biotin reduction label na naglalaman ng cleavable linker, na sinusundan ng neutravidin stretching at trypsin digestion.Ang binagong peptide, na nakagapos pa rin sa dagta, ay na-photocleaved para sa pagsusuri ng LC-MS/MS (Larawan 2a at Karagdagang Data 1).Ang isang malaking bilang ng mga pagbabago ay naganap sa buong proteome na may higit sa 50 peptide map (PSM) na mga tugma na nakalista (Fig. 2b).Nakakagulat, napansin lamang namin ang pagbabago ng histidine, marahil dahil sa mas mataas na reaktibiti ng oxidized histidine patungo sa aniline probes kaysa sa iba pang mga amino acid.Ayon sa nai-publish na mekanismo ng histidine oxidation sa pamamagitan ng singlet oxygen, 21,33 ang iminungkahing delta-mass na istraktura ng +229 Da ay tumutugma sa adduct ng probe 3 na may 2-oxo-histidine pagkatapos ng dalawang oksihenasyon, habang ang +247 Da ay ang produkto ng hydrolysis. ng +229 Da (Karagdagang Larawan 5).Ang pagsusuri ng MS2 spectrum ay nagpakita ng mataas na pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan ng karamihan sa mga y at b ion, kabilang ang pagkilala sa mga binagong fragment ions (y at b) (Fig. 2c).Ang pagsusuri sa konteksto ng lokal na pagkakasunud-sunod ng mga histidine na binago ng PDPL ay nagsiwalat ng isang katamtamang kagustuhan sa motif para sa mga maliliit na hydrophobic residues sa ± 1 na posisyon (Karagdagang Fig. 4b).Sa karaniwan, 1.4 histidines ang natukoy sa bawat protina, at ang mga site ng mga marker na ito ay tinutukoy ng solvent accessible surface area (SASA) at relative solvent availability (RSA) analysis (Karagdagang Fig. 4c, d).
Isang walang pinapanigan na daloy ng trabaho para sa pag-aaral ng natitirang selectivity gamit ang FragPipe computing platform na pinapagana ng MSFragger.Ang mga cleavable linker ay ginagamit sa Click chemistry upang payagan ang photocleavage ng mga binagong peptide mula sa streptavidin resin.Ang isang bukas na paghahanap ay inilunsad upang matukoy ang maraming mga pagbabago, pati na rin ang mga nauugnay na labi.b Italaga ang masa ng mga pagbabagong nagaganap sa buong proteome.Peptide mapping PSM.c MS2 spectral annotation ng histidine sites na binago ng probe 3. Bilang isang halimbawang kinatawan, ang isang covalent reaction na may probe 3 ay nagdagdag ng +229.0938 Da sa binagong amino acid.d Mutation assay na ginamit upang subukan ang mga marker ng PDPL.Ang PRDX3 (H155A, H225A) at PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ay inilipat gamit ang mga wild-type na plasmids para sa anti-Flag detection.Ang synthetic peptide ay na-react sa purified miniSOG sa pagkakaroon ng probe 3 at ang kaukulang mga produkto na may Δm +247 at +229 ay nabanggit sa LC-MS spectrum.f In vitro protein-to-protein na mga pakikipag-ugnayan na namodelo gamit ang miniSOG-6xHis-tag at anti-6xHis antibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) at anti-mouse Western blot analysis ng miniSOG-6xHis/anti-6xHis antibody complexes na may label na probe 3, depende sa oras ng pagkakalantad sa liwanag.Ang mga label para sa mga indibidwal na protina ay ipinahayag sa kaukulang molekular na timbang: LC antibody light chain, HC antibody heavy chain.Ang mga eksperimentong ito ay nakapag-iisa na inulit nang hindi bababa sa dalawang beses na may katulad na mga resulta.
Para sa biochemical verification ng labeling site, ang PRDX3 at PRDX1 na kinilala ng mass spectrometry ay binago mula histidine hanggang alanine at inihambing sa wild type sa transfection assays.Ang mga resulta ng PDPL ay nagpakita na ang mutation ay makabuluhang nabawasan ang pag-label (Larawan 2d).Samantala, ang mga pagkakasunud-sunod ng peptide na natukoy sa bukas na paghahanap ay na-synthesize at nag-react sa vitro na may purified miniSOG sa pagkakaroon ng probe 3 at asul na ilaw, na nagbubunga ng mga produkto na may mass shift ng +247 at +229 Da kapag nakita ng LC-MS (Fig . 2e).).Upang masubukan kung ang pakikipag-ugnay sa mga proximal na protina ay maaaring ma-label sa vitro bilang tugon sa miniSOG photoactivation, nagdisenyo kami ng isang artipisyal na proximity assay sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng miniSOG-6xHis protein at isang anti-His monoclonal antibody in vitro (Larawan 2f).Sa assay na ito, inaasahan namin ang proximal na label ng antibody heavy at light chain na may miniSOG.Sa katunayan, ang anti-mouse (pagkilala sa mabibigat at magaan na chain ng anti-6xHis-labeled na antibody) at streptavidin Western blots ay nagpakita ng malakas na biotinylation ng mabibigat at magaan na chain.Kapansin-pansin, napansin namin ang miniSOG autobiotinylation dahil sa 6xHis tag at mga cross-link sa pagitan ng magaan at mabibigat na kadena, na maaaring nauugnay sa naunang inilarawan na puwang sa pagitan ng lysine at 2-oxo-histidine proximal na tugon.Sa konklusyon, napagpasyahan namin na binabago ng PDPL ang histidine sa paraang umaasa sa malapit.
Ang aming susunod na layunin ay upang makilala ang subcellular proteome upang masubukan ang pagiging tiyak ng in situ na pag-label.Samakatuwid, matatag naming ipinahayag ang miniSOG sa nucleus, mitochondrial matrix, o panlabas na ER membrane ng HEK293T cells (Fig. 3a).Ang pagsusuri sa fluorescence ng gel ay nagsiwalat ng masaganang may label na mga banda sa tatlong subcellular na lokasyon pati na rin ang iba't ibang mga pattern ng pag-label (Larawan 3b).Ang pagsusuri ng fluorescence imaging ay nagpakita ng mataas na pagtitiyak ng PDPL (Larawan 3c).Ang daloy ng trabaho ng PDPL ay sinundan ng mga reaksyon ng pag-click na may mga rhodamine dyes upang i-delineate ang mga subcellular proteomes gamit ang fluorescence microscopy, at ang mga signal ng PDPL ay na-colocalize sa DAPI, mitochondrial tracker, o ER tracker, na nagpapatunay sa mataas na katapatan ng PDPL.Para sa tatlong lokasyon ng organelle, ang isang magkatabing paghahambing ng PDPL sa TurboID gamit ang avidin western blot ay nagpakita na ang PDPL ay may label na mas partikular kumpara sa kani-kanilang mga kontrol.Sa ilalim ng mga kondisyon ng PDPL, mas maraming may label na banda ang lumitaw, na nagpapahiwatig ng higit pang mga protina na may label na PDPL (Karagdagang Fig. 6a-d).
isang Schematic na representasyon ng miniSOG-mediated organelle-specific na proteome labeling.Tina-target ng miniSOG ang mitochondrial matrix sa pamamagitan ng fusion sa N-terminal 23 amino acids ng human COX4 (mito-miniSOG), ang nucleus sa pamamagitan ng fusion sa H2B (nucleus-miniSOG), at Sec61β sa pamamagitan ng cytoplasmic side ng ER membrane (ER-miniSOG). ).Kasama sa mga indikasyon ang gel imaging, confocal imaging, at mass spectrometry.b Mga larawan ng kinatawan ng gel ng tatlong mga profile ng PDPL na partikular sa organelle.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Representative confocal images ng HEK293T cells na matatag na nagpapahayag ng miniSOG na may iba't ibang subcellular localization na nakita ng antibody na may label na V5 (pula).Ang mga subcellular marker ay ginagamit para sa mitochondria at ER (berde).Kasama sa daloy ng trabaho ng PDPL ang pagtuklas ng mga miniSOG (dilaw) na may label na mga subcellular proteome gamit ang Cy3-azide click chemistry.Scale bar: 10 µm.d Volcanic plots ng PDPL-tag na proteomes sa iba't ibang organelles na binibilang ng walang label na quantification (n = 3 independiyenteng biological na eksperimento).Ginamit ang two-tailed Student's t-test sa mga plot ng bulkan.Ang HEK293T wild type ay ginamit bilang isang negatibong kontrol. Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at > 2-tiklop na pagkakaiba sa lakas ng ionic).Ang mga nauugnay na protina na mahalaga para sa HEK293T-miniSOG ngunit hindi mahalaga para sa HEK293T ay ipinapakita sa berde.e Pagsusuri ng pagiging tiyak ng mga proteomic na dataset mula sa mga eksperimento d.Ang kabuuang bilang ng mga istatistikal na makabuluhang protina sa bawat organelle (pula at berdeng tuldok) ay minarkahan sa itaas.Ang mga histogram ay nagpapakita ng mga protina na naisalokal sa mga organel batay sa MitoCarta 3.0, pagsusuri ng GO at A. Ting et al.mga tao.Paghiwalayin ang mga dataset para sa mitochondria, nuclei, at ER.Ang mga eksperimentong ito ay nakapag-iisa na inulit nang hindi bababa sa dalawang beses na may katulad na mga resulta.Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Hinihikayat ng mga resulta ng gel at imaging, ginamit ang walang label na dami upang mabilang ang natukoy na proteome sa bawat organelle (Karagdagang Data 2).Ang hindi nailipat na HEK293T ay ginamit bilang isang negatibong kontrol upang ibawas ang mga marker sa background. Ang pagsusuri sa plot ng bulkan ay nagpakita ng makabuluhang pinayaman na mga protina (p <0.05 at >2-fold na intensity ng ion) pati na rin ang mga singleton na protina na naroroon lamang sa mga linyang nagpapahayag ng miniSOG (Larawan 3d na pula at berdeng mga tuldok). Ang pagsusuri sa plot ng bulkan ay nagpakita ng makabuluhang pinayaman na mga protina (p <0.05 at >2-fold na intensity ng ion) pati na rin ang mga singleton na protina na naroroon lamang sa mga linyang nagpapahayag ng miniSOG (Larawan 3d na pula at berdeng mga tuldok). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Ang pagsusuri sa plot ng bulkan ay nagpakita ng makabuluhang pinayaman na mga protina (p<0.05 at >2-fold na intensity ng ion) pati na rin ang mga solong protina na naroroon lamang sa mga linyang nagpapahayag ng miniSOG (Larawan 3d, pula at berdeng mga tuldok).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 。。。））））））））））） 。。。）））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Ang pagsusuri sa plot ng bulkan ay nagsiwalat ng makabuluhang pinayaman na mga protina (p<0.05 at> 2x na lakas ng ionic) pati na rin ang mga solong protina na naroroon lamang sa linya ng expression ng miniSOG (pula at berdeng mga tuldok sa Fig. 3d).Ang pagsasama-sama ng mga datos na ito, natukoy namin ang 1364, 461, at 911 na makabuluhang istatistika na nuklear, mitochondrial, at ER na panlabas na mga protina ng lamad, ayon sa pagkakabanggit.Upang pag-aralan ang katumpakan ng organelle-localized PDPL, ginamit namin ang MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analysis, at A. Ting et al.isang data set8 ang ginamit para sa mitochondria, nucleus, at ER upang subukan ang organelle specificity ng mga nakitang protina, na tumutugma sa isang katumpakan ng 73.4, 78.5, at 73.0% (Fig. 3e).Kinukumpirma ng pagtitiyak ng PDPL na ang PDPL ay isang mainam na tool para sa pagtukoy ng mga proteome na partikular sa organelle.Kapansin-pansin, ang pagsusuri ng submitochondrial ng natukoy na mga protina ng mitochondrial ay nagpakita na ang nakulong na proteome ay pangunahing ipinamamahagi sa matrix at panloob na lamad (226 at 106, ayon sa pagkakabanggit), na nagkakaloob ng 91.7% (362) ng kabuuang bilang ng mga natukoy na protina ng mitochondrial.ang isang mataas na antas ng PDPL ay karagdagang nakumpirma (Karagdagang Fig. 7a).Katulad nito, ipinakita ng pagsusuri ng subnuclear na ang nakuhang proteome ay pangunahing ipinamamahagi sa nucleus, nucleoplasm, at nucleolus (Karagdagang Fig. 7b).Ang nuclear proteomic analysis na may nuclear localization signal peptide (3xNLS) ay nagpakita ng katulad na katumpakan sa H2B construct (Karagdagang Fig. 7c–h).Upang matukoy ang pagiging tiyak ng marker ng PDPL, ang nuclear laminin A ay pinili bilang isang mas discretely localized POI7 trap.Natukoy ng PDPL ang 36 na makabuluhang pinayaman na mga protina, kung saan 12 na protina (30.0% kabilang ang lamin A) ay mahusay na nailalarawan sa lamin A na nakikipag-ugnay na mga protina na na-annotate ng String database, na may mas mataas na porsyento kaysa sa BioID na pamamaraan (122 na protina) 28 ng 28. , 22.9 %) 7. Natukoy ng aming pamamaraan ang mas kaunting mga protina, posibleng dahil sa limitadong mga lugar ng pag-label, na naging posible ng mas aktibong singlet na oxygen.Ipinakita ng pagsusuri ng GO na ang mga natukoy na protina ay pangunahing matatagpuan sa nucleoplasm (26), nuclear membrane (10), nuclear membrane (9), at nuclear pores (5).Sama-sama, ang mga nuclear-localized na protina na ito ay nagkakahalaga ng 80% ng mga enriched na protina, na higit pang nagpapakita ng pagiging tiyak ng PDPL (Karagdagang Fig. 8a–d).
Nang maitatag ang kakayahan ng PDPL na magsagawa ng proximity marking sa mga organelles, sinubukan namin kung magagamit ang PDPL upang suriin ang mga kasosyong nagbubuklod ng POI.Sa partikular, hinahangad naming tukuyin ang pagsusuri ng PDPL ng mga cytosolic protein, na itinuturing na mas mahirap na mga target kaysa sa kanilang mga katapat na na-localize ng lamad dahil sa kanilang lubos na pabago-bagong kalikasan.Ang bromodomain at extraterminal (BET) na protina na BRD4 ay nakakuha ng aming pansin para sa pangunahing papel nito sa iba't ibang sakit 35, 36 .Ang complex na nabuo ng BRD4 ay isang transcriptional coactivator at isang mahalagang therapeutic target.Sa pamamagitan ng pag-regulate ng expression ng c-myc at Wnt5a transcription factor, ang BRD4 ay naisip na isang pangunahing determinant ng acute myeloid leukemia (AML), multiple myeloma, Burkitt's lymphoma, colon cancer at inflammatory disease37,38.Dagdag pa rito, tina-target ng ilang virus ang BRD4 na i-regulate ang viral at cellular transcription, gaya ng papillomavirus, HIV, at SARS-CoV-236,39.
Upang i-map ang pakikipag-ugnayan ng BRD4 gamit ang PDPL, pinagsama namin ang miniSOG sa isang maikling N- o C-terminal isoform ng BRD4.Ang mga resulta ng proteomic ay nagsiwalat ng mataas na antas ng overlap sa pagitan ng dalawang konstruksyon (Karagdagang Fig. 9a).Ang nuclear proteome na kinilala sa miniSOG-H2B ay sumasaklaw sa 77.6% ng mga protina na nakikipag-ugnayan sa BRD4 (Karagdagang Fig. 9b).Pagkatapos, ang iba't ibang oras ng pag-iilaw (2, 5, 10, 20 min) ay ginamit upang ayusin ang radius ng marker (Larawan 4a at karagdagang data 3).Napagpasyahan namin na sa mas maiikling mga photoperiod, ang PDPL ay pangunahing maglalagay ng label sa mga direktang nagbubuklod na kasosyo, habang ang mas mahabang panahon ay magsasama ng mga protina na natukoy sa mas maikling panahon ng photoactivation pati na rin ang mga hindi direktang target sa mga labeling complex.Sa katunayan, natagpuan namin ang malakas na overlap sa pagitan ng mga katabing puntos ng oras (84.6% para sa 2 at 5 min; 87.7% para sa 5 at 10 min; 98.7% para sa 10 at 20 min) (Larawan 4b at Karagdagang Fig. 9c).Sa lahat ng pang-eksperimentong pangkat, nakita namin hindi lamang ang BRD4 na self-labeling, ngunit ilang kilalang target gaya ng MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, at HMGB1 na naka-annotate sa string database.Ang lakas ng ionic ng mga target na ito ay proporsyonal sa oras ng pagkakalantad (Fig. 4c at Pandagdag na Fig. 9d).Ang pagsusuri ng GO ng mga protina na natukoy sa 2-minutong grupo ay nagpakita na ang mga natukoy na protina ay naisalokal sa nucleus at kasangkot sa chromatin remodeling at RNA polymerase function.Ang molecular function ng protina ay pinayaman sa chromatin binding o transcriptional coactivation, na naaayon sa BRD4 function (Fig. 4d).Ang pagtatasa ng pakikipag-ugnayan ng protina na pinagana ng database ng string ay nagsiwalat ng unang antas ng mga hindi direktang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng BRD4 at HDAC family interacting complexes tulad ng SIN3A, NCOR2, BCOR, at SAP130 (Fig. 4e at Pandagdag na Fig. 9e), na naaayon sa BRD4 at HDAC na nagbubuklod ng acetylated histones ..Bilang karagdagan, ang mga kinatawan na target na kinilala ng LC-MS/MS, kabilang ang Sin3A, NSUN2, Fus, at SFPQ, ay nakumpirma ng Western blotting (Fig. 4f).Kamakailan lamang, ang maikling isoform ng BRD4 ay naiulat na bumubuo ng nuclei na may mga katangian ng liquid-liquid phase separation (LLPS).Ang mga protina na nagbubuklod ng RNA na Fus at SFPQ ay namamagitan sa LLPS ng iba't ibang mga proseso ng cellular at nakilala dito bilang hindi naitala na mga protina na nagbubuklod ng BRD4.Ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng BRD4 at SFPQ ay nakumpirma ng mga eksperimento ng co-immunoprecipitation (co-IP) (Larawan 4g), na nagmumungkahi ng isa pang mekanismo para sa BRD4-mediated na likido-likido na bahagi ng paghihiwalay na nararapat sa karagdagang pagsisiyasat.Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang PDPL ay isang perpektong platform para sa pagtukoy ng kilalang BRD4 na nakikipag-ugnayan pati na rin ang hindi kilalang mga nagbubuklod na protina.
isang Schematic na representasyon ng miniSOG-mediated BRD4 proximity marking, mga oras ng pagkakalantad: 2, 5, 10, at 20 min.b Ang overlap ng mga protina na natukoy sa iba't ibang oras ng pag-iilaw.Ang pagpapayaman ng protina na natukoy sa HEK293T-miniSOG-BRD4 ay makabuluhan sa istatistika kumpara sa wild-type na HEK293T.c Ion intensity kapag binibilang ang walang label na kinatawan na kilala na BRD4-binding protein sa panahon ng tinukoy na oras ng pagkakalantad.n = 3 biologically independent sample.Ang data ay ipinakita bilang mean ± standard deviation.d Gene ontological analysis (GO) ng mga protina na natukoy sa 2 minutong grupo.Nakalista ang unang sampung termino ng GO.Ang mga bula ay may kulay ayon sa kategoryang GO term, at ang laki ng bubble ay proporsyonal sa bilang ng mga protina na matatagpuan sa bawat termino.e String analysis ng mga protina na nakikipag-ugnayan sa BRD4.Ang mga dilaw na bilog ay direktang pandikit at ang mga kulay abong bilog ay ang unang layer ng hindi direktang pandikit.Ang mga pulang linya ay kumakatawan sa mga eksperimento na tinutukoy na mga pakikipag-ugnayan at ang mga asul na linya ay kumakatawan sa mga hinulaang pakikipag-ugnayan.f Ang mga kinatawan na BRD4 na nagbubuklod na target na natukoy sa LC-MS/MS ay na-verify sa pamamagitan ng Western blotting.g Kinukumpirma ng mga eksperimento sa co-immunoprecipitation ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng SFPQ at BRD4.Ang mga eksperimentong ito ay nakapag-iisa na inulit nang hindi bababa sa dalawang beses na may katulad na mga resulta.Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Bilang karagdagan sa pagtukoy ng mga hindi rehistradong target na nauugnay sa POI, ipinapalagay namin na ang PDPL ay magiging angkop para sa pagtukoy ng mga substrate para sa mga enzyme, na mangangailangan ng pagkilala sa mga hindi direktang nagbubuklod na protina sa malalaking complex upang i-annotate ang mga hindi rehistradong substrate.Ang Parkin (naka-encode ng PARK2) ay isang E3 ligase at ang mga mutasyon sa parkin ay kilala na nagiging sanhi ng autosomal recessive juvenile na Parkinson's disease (AR-JP)42.Bilang karagdagan, ang parkin ay inilarawan bilang mahalaga para sa mitophagy (mitochondrial autophagy) at pag-alis ng mga reaktibo na species ng oxygen.Gayunpaman, kahit na maraming mga substrate ng parkin ang natukoy, ang papel ng parkin sa sakit na ito ay nananatiling hindi maliwanag.Upang i-annotate ang mga hindi na-characterized na substrate nito, sinubukan ang PDPL sa pamamagitan ng pagdaragdag ng miniSOG sa N- o C-terminus ng parkin.Ang mga cell ay ginagamot sa carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) upang maisaaktibo ang parkin sa pamamagitan ng PINK1-Parkin pathway.Kung ikukumpara sa aming mga resulta ng BRD4 PDPL, ang parkin N-terminus fusion ay nagsiwalat ng isang mas malaking hanay ng mga target na protina, kahit na sakop nito ang isang mas malaking bahagi ng C-terminus (177 sa 210) (Larawan 5a, b at Karagdagang Data 4).ang resulta ay pare-pareho sa mga ulat na ang mga tag ng N-terminal ay maaaring aberrant na i-activate ang Parkin44.Nakapagtataka, mayroon lamang 18 na magkakapatong na protina sa aming data na may nai-publish na mga resulta ng AP-MS para sa Parkin43, malamang dahil sa mga pagkakaiba sa pagitan ng mga linya ng cell at mga daloy ng trabaho ng proteomics.Bilang karagdagan sa apat na kilalang protina (ARDM1, HSPA8, PSMD14, at PSMC3) na kinilala sa pamamagitan ng dalawang pamamaraan (Larawan 5c)43.Upang higit pang mapatunayan ang mga resulta ng LC-MS/MS, ang paggamot sa PDPL at kasunod na Western blotting ay ginamit upang ihambing ang mga resulta ng HEK293T parent cell assay at ang stable na N-terminal parkin line.Ang mga dating hindi kilalang target na CDK2, DUT, CTBP1, at PSMC4 ay sinubukan gamit ang isang kilalang binder, DNAJB1 (Larawan 5d).
Volcano plot ng parkin-interacting proteins sa HEK293T cells na may stably expressed miniSOG fused sa N- o C-terminus ng parkin (n = 3 independiyenteng biological na eksperimento).Ginamit ang two-tailed Student's t-test sa mga plot ng bulkan.Ginamit ang HEK293T bilang isang negatibong kontrol. Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at> 2-tiklop na pagkakaiba sa intensity ng ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ang mga makabuluhang binagong protina ay naka-highlight sa pula (p <0.05 at > 2-tiklop na pagkakaiba sa lakas ng ionic).Ang mga nauugnay na protina na mahalaga para sa HEK293T-miniSOG ngunit hindi mahalaga para sa HEK293T ay ipinapakita sa berde.b Venn diagram na nagpapakita ng magkakapatong na mga protina sa pagitan ng mga konstruksyon ng N-terminal at C-terminal.Ang mga tag ng N-terminal ay maaaring aberrant na i-activate ang parkin at magresulta sa mas makikilalang mga protina.c Venn diagram na nagpapakita ng magkakapatong na mga protina sa pagitan ng PDPL at AP-MS.Nakalista ang mga kilalang interaktor, kabilang ang 4 sa 18 na magkakapatong na protina at 11 sa 159 na protina na partikular na tinukoy sa PDPL.d Ang mga target na kinatawan na tinukoy ng LC-MS/MS ay na-verify sa pamamagitan ng Western blotting.Ang Ssu72 at SNW1 ay nakilala bilang hindi rehistradong mga substrate ng parkin.Ang mga plasmid na protina na may tag na FLAG na ito ay inilipat sa HEK293T at HEK293T-Parkin-miniSOG na sinundan ng paggamot sa CCCP sa iba't ibang mga oras ng oras.Ang pagkasira ay mas malinaw sa Parkin overexpression line.f Gamit ang proteasome inhibitor MG132, nakumpirma na ang proseso ng pagkasira ng Ssu72 at SNW1 ay pinagsama ng proteasome-ubiquitination.Ang mga eksperimentong ito ay nakapag-iisa na inulit nang hindi bababa sa dalawang beses na may katulad na mga resulta.Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Kapansin-pansin, ang mga protina na kinilala ng PDPL ay dapat magsama ng mga protina na nagbubuklod ng parkin at ang kanilang mga substrate.Upang makita ang hindi rehistradong mga substrate ng parkin, pumili kami ng pitong natukoy na protina (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 at SNW1) at mga inilipat na plasmid upang ilantad ang mga gen na ito sa normal na HEK293T at matatag na nagpapahayag ng miniSOG-Parkin's HEK293T na paggamot na sinusundan ng CCCP na paggamot.Ang mga antas ng mga protina ng Ssu72 at SNW1 ay makabuluhang nabawasan sa matatag na linya ng miniSOG-Parkin (Larawan 5e).Ang paggamot sa CCCP sa loob ng 12 oras ay nagresulta sa pinaka makabuluhang pagkasira ng parehong mga substrate.Upang siyasatin kung ang pagkasira ng Ssu72 at SNW1 ay kinokontrol ng proteasome-ubiquitination, ang proteasome inhibitor MG132 ay idinagdag upang pigilan ang aktibidad ng proteasome, at sa katunayan nalaman namin na ang kanilang proseso ng pagkasira ay napigilan (Fig. 5f).Ang mga karagdagang non-substrate na target ay nakumpirma bilang mga interaksyon ng Parkin gamit ang Western blotting (Karagdagang Fig. 10), na nagpakita ng pare-parehong mga resulta sa LC-MS/MS.Sa konklusyon, ang pagsasama ng workflow ng PDPL na may target na pag-verify ng transfection ng protina ay nagbibigay-daan sa pagkilala sa mga hindi rehistradong E3 ligase substrates.
Bumuo kami ng isang karaniwang platform ng pagmamarka ng kalapitan na nagbibigay-daan sa iyong tukuyin ang mga POI na nakikipag-ugnayan sa espasyo at oras.Ang platform ay batay sa miniSOG photosensitizer protein, na halos 12 kDa lamang, mas mababa sa kalahati ng laki ng mature na APEX2 enzyme (27 kDa) at isang third ang laki ng TurboID (35 kDa).Ang mas maliit na sukat ay dapat na lubos na mapalawak ang hanay ng mga aplikasyon para sa pag-aaral ng maliliit na pakikipag-ugnayan ng protina.Ang karagdagang paggalugad ng mga karagdagang photosensitizer, kung genetically encoded na mga protina o maliliit na molekula, ay kailangan upang mapataas ang dami ng ani ng singlet oxygen at mapalawak ang sensitivity ng diskarteng ito.Para sa kasalukuyang bersyon ng miniSOG, maaaring makamit ang mataas na temporal na resolution gamit ang asul na pag-iilaw upang i-activate ang mga proximity marker.Bilang karagdagan, ang mas mahabang oras ng pagkakalantad ay naglabas ng mas malaking "ulap" ng singlet na oxygen, na nagreresulta sa pagbabago ng mas malayong mga residue ng histidine, tumaas na radius ng pag-label, at kakayahang i-fine-tune ang PDPL spatial resolution.Sinubukan din namin ang pitong mga probe ng kemikal upang madagdagan ang ratio ng signal-to-background at ginalugad ang mekanismo ng molekular sa likod ng diskarteng ito.Ang daloy ng trabaho ng TOP-ABPP na sinamahan ng walang pinapanigan na bukas na paghahanap ay nakumpirma na ang mga pagbabago ay naganap lamang sa mga histidine at walang pare-parehong microenvironment na naobserbahan para sa mas mataas na mga pagbabago sa histidine, maliban sa isang katamtamang kagustuhan para sa mga histidine sa rehiyon ng loop.
Ginamit din ang PDPL upang makilala ang mga subcellular proteomes na may proteome specificity at coverage na hindi bababa sa maihahambing sa iba pang proximity labeling at organelle-specific na chemical probe na pamamaraan.Matagumpay ding ginamit ang mga proximity marker upang makilala ang surface, lysosomal, at secretome-associated proteomes46,47.Naniniwala kami na ang PDPL ay magiging tugma sa mga subcellular organelle na ito.Bilang karagdagan, hinamon namin ang PDPL sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga target para sa pagbubuklod ng cytosolic na protina na mas kumplikado kaysa sa mga protina na nakagapos sa lamad dahil sa kanilang mga dinamikong katangian at paglahok sa mas temporal na pakikipag-ugnayan.Ang PDPL ay inilapat sa dalawang protina, ang transcriptional coactivator BRD4 at ang ligase na nauugnay sa sakit na E3 Parkin.Ang dalawang protina na ito ay pinili hindi lamang para sa kanilang mga pangunahing biological function, kundi pati na rin para sa kanilang klinikal na kaugnayan at therapeutic potensyal.Para sa dalawang POI na ito, natukoy ang mga kilalang nagbubuklod na kasosyo gayundin ang mga hindi rehistradong target.Kapansin-pansin, ang phase separation-associated protein SFPQ ay nakumpirma ng co-IP, na maaaring magpahiwatig ng isang bagong mekanismo kung saan kinokontrol ng BRD4 (maikling isoform) ang LLPS.Kasabay nito, naniniwala kami na ang pagkakakilanlan ng mga substrate ng Parkin ay isang senaryo kung saan kinakailangan ang pagkakakilanlan ng mga hindi direktang pandikit.Nakilala namin ang dalawang hindi kilalang mga substrate ng parkin at nakumpirma ang kanilang pagkasira kasama ang ubiquitination-proteasome pathway.Kamakailan lamang, binuo ang isang diskarte sa pag-trap na nakabatay sa mekanismo upang makita ang mga hydrolase substrate sa pamamagitan ng pag-trap sa kanila ng mga enzyme.Bagaman ito ay isang napakalakas na pamamaraan, hindi ito angkop para sa pagsusuri ng mga substrate na kasangkot sa pagbuo ng mga malalaking complex at nangangailangan ng pagbuo ng mga covalent bond sa pagitan ng enzyme at substrate.Inaasahan namin na ang PDPL ay maaaring mapalawak upang pag-aralan ang iba pang mga kumplikadong protina at mga pamilya ng enzyme, tulad ng mga pamilyang deubiquitinase at metalloprotease.
Isang bagong anyo ng miniSOG, na tinatawag na SOPP3, ay binuo na may pinahusay na produksyon ng singlet oxygen.Inihambing namin ang miniSOG sa SOPP3 at natagpuan ang pinahusay na pagganap ng pagmamarka, kahit na ang ratio ng signal-to-ingay ay nanatiling hindi nagbabago (Karagdagang Fig. 11).Ipinagpalagay namin na ang pag-optimize ng SOPP3 (halimbawa, sa pamamagitan ng nakadirekta na ebolusyon) ay hahantong sa mas mahusay na mga protina ng photosensitizer na nangangailangan ng mas maikling oras ng liwanag at sa gayon ay nagbibigay-daan sa mas maraming dinamikong proseso ng cellular na makuha.Kapansin-pansin, ang kasalukuyang bersyon ng PDPL ay limitado sa cellular na kapaligiran dahil nangangailangan ito ng asul na liwanag na pag-iilaw at hindi maaaring tumagos sa malalim na mga tisyu.Pinipigilan ng tampok na ito ang paggamit nito sa mga pag-aaral ng modelo ng hayop.Gayunpaman, ang kumbinasyon ng optogenetics sa PDPL ay maaaring magbigay ng pagkakataon para sa pagsasaliksik ng hayop, lalo na sa utak.Bilang karagdagan, inaalis din ng ibang mga engineered infrared photosensitizer ang limitasyong ito.Ang pananaliksik ay kasalukuyang isinasagawa sa lugar na ito.
Ang HEK293T cell line ay nakuha mula sa ATCC (CRL-3216).Ang cell line ay nagsubok ng negatibo para sa impeksyon sa mycoplasma at na-culture sa DMEM (Thermo, #C11995500BT) na dinagdagan ng 10% fetal bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) at 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).lumaki sa.
Ang 3-Aminophenylene (sample 3) at (4-ethynylphenyl)methanamine (sample 4) ay binili mula sa Bidepharm.Ang propylamine (probe 2) ay binili mula sa Energy-chemicals.Ang N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) ay na-synthesize ayon sa nai-publish na mga pamamaraan.
Inililista ng Karagdagang Talahanayan 1 ang mga genetic construct na ginamit sa pag-aaral na ito.Ang mga sequence ng miniSOG at KillerRed ay na-clone mula sa isang regalong plasmid mula sa P. Zou (Peking University).Ang pagkakasunud-sunod ng pag-target ng mitochondrial matrix ay nagmula sa 23 N-terminal amino acid ng COX4 at na-clone sa ipinahiwatig na mga vector gamit ang isang Gibson assembly (Beyotime, #D7010S).Upang i-target ang lamad at nucleus ng endoplasmic reticulum, SEC61B human DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) na pinalakas ng PCR mula sa isang cDNA library ng HEK293T cells, at H2B DNA (donated ni D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) at na-clone , tulad ng nabanggit sa itaas.Maliban kung ipinahiwatig, ang iba pang mga gen ng protina na ginamit para sa paglipat at pagtatayo ng mga matatag na linya ng cell ay pinalaki ng PCR mula sa HEK293T cell cDNA library.Ang G3S (GGGS) at G4S (GGGGS) ay ginamit bilang mga link sa pagitan ng bait protein at miniSOG.Isang V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) ang idinagdag sa mga fusion construct na ito.Para sa pagpapahayag sa mga mammal at upang magtatag ng isang matatag na linya ng cell, ang miniSOG fusion construct ay na-subclone sa pLX304 lentiviral vector.Para sa pagpapahayag ng bakterya, ang miniSOG ay na-clone sa pET21a vector na may label na 6xHis sa C-terminus.
Ang mga cell ng HEK293T ay na-seeded sa 2.0 x 105 na mga cell bawat balon sa anim na balon na mga plato at inilipat pagkalipas ng 24 na oras kasama ang mga recombinant lentiviral plasmids (2.4 μg pLX304) at mga viral packaging plasmids (1.5 μg psPAX2 at 1.2 μg pMD2.G00) gamit ang Lipoyotime (0. , #C0533), humigit-kumulang 80% fusion.Pagkatapos ng magdamag na paglipat, ang daluyan ay pinalitan at incubated para sa isa pang 24 na oras.Ang koleksyon ng virus ay isinagawa pagkatapos ng 24, 48 at 72 na oras.Bago ang impeksyon ng mga target na linya ng cell, ang viral medium ay na-filter sa pamamagitan ng isang 0.8 μm filter (Merck, #millex-GP) at polybrene (Solarbio, #H8761) ay idinagdag sa isang konsentrasyon ng 8 μg / ml.Pagkatapos ng 24 na oras, ang mga cell ay pinahintulutang mabawi sa pamamagitan ng pagpapalit ng daluyan.Napili ang mga cell gamit ang 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) para sa unang tatlong mga sipi bilang isang mas mababang mahigpit na pagpili.Pagkatapos ay gumamit ng 20 μg/ml bilang isang mas mahigpit na regimen para sa susunod na tatlong mga sipi.
Ang mga cell ay na-seeded sa 12-well chambers (Ibidi, #81201) sa density na humigit-kumulang 20,000 cells bawat balon.Upang mapabuti ang pagdirikit ng HEK293T cells, magdagdag ng 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) na diluted sa phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) sa 37°C.Ang mga silid ay pretreated sa loob ng 1 oras at pagkatapos ay tinanggal gamit ang PBS.Pagkatapos ng 24 h, ang mga cell ay hinugasan ng isang beses gamit ang PBS, na incubated na may 1 mM probe 3 sa sariwang Hanks' balanseng solusyon sa asin (HBSS, Gibco, #14025092) para sa 1 h sa 37 ° C, at pagkatapos ay incubated na may asul na LED (460 nm ).) ay na-irradiated para sa 10 min sa temperatura ng silid.Pagkatapos nito, ang mga cell ay hugasan ng dalawang beses sa PBS at naayos na may 4% formaldehyde sa PBS (Sangon, #E672002) sa loob ng 15 minuto sa temperatura ng silid.Ang sobrang formaldehyde ay tinanggal mula sa mga nakapirming cell sa pamamagitan ng paghuhugas ng tatlong beses gamit ang PBS.Ang mga cell ay pagkatapos ay na-permeabilisado na may 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) sa PBS at hugasan ng 3 beses gamit ang PBS.Pagkatapos ay alisin ang silid at idagdag sa bawat sample ang 25 µl ng isang click reaction mixture na naglalaman ng 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) at 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) at incubated sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng kuwarto.Pagkatapos ng snap reaction, ang mga cell ay hinugasan ng anim na beses na may PBS na naglalaman ng 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) at pagkatapos ay hinarangan ng 5% BSA (Abcone, #B24726) sa PBST sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid.
Para sa immunostaining ng colocalization, ang mga cell ay natupok ng mga pangunahing antibodies ayon sa ipinahiwatig na mga kondisyon: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), rabbit polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) o rabbit anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) sa 4 °C magdamag.Pagkatapos ng paghuhugas ng 3 beses gamit ang PBST, ang mga cell ay incubated na may pangalawang antibodies: goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, goat anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.dilution Maghalo sa temperatura ng kuwarto sa loob ng 30 minuto.Ang mga cell ay pagkatapos ay hugasan ng 3 beses gamit ang PBST at na-counterstain ng DAPI (Thermo, #D1306) sa PBS sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid.Pagkatapos ng 3 paghuhugas gamit ang PBS, ang mga cell ay na-sealed sa 50% glycerol (Sangon, #A600232) sa PBS para sa imaging.Ang mga immunofluorescent na imahe ay nakuha gamit ang isang ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope at ZNE 3.5 software.
Para sa singlet oxygen fluorescent imaging, ang mga cell ay hinugasan ng dalawang beses gamit ang Hanks HEPES buffer bago magdagdag ng 100 nM Si-DMA sa Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05).Pagkatapos ng pagkakalantad sa liwanag, ang mga cell ay incubated sa isang CO2 incubator sa 37 ° C sa loob ng 45 minuto.Ang mga cell ay hugasan nang dalawang beses gamit ang Hanks' HEPES buffer at na-counterstain ng Hoechst sa Hanks' HEPES buffer sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid at na-visualize gamit ang isang ZEISS LSM 900 confocal microscope., #M36008) sa HBSS buffer na naglalaman ng calcium at magnesium.Pagkatapos ng pagkakalantad sa liwanag o doxorubicin (MCE, #HY-15142A), ang mga cell ay incubated sa isang CO2 incubator sa 37° C. sa loob ng 10 minuto, hugasan ng dalawang beses gamit ang HBSS buffer, at incubated gamit ang Hoechst sa HBSS buffer sa temperatura ng kuwarto.minuto.Ginamit ang Doxorubicin bilang isang positibong kontrol ng probe kung saan ang mga cell ay ginagamot ng 20 μM doxorubicin sa HBSS na naglalaman ng 1% BSA sa loob ng 30 min.Ang mga immunofluorescent na imahe ay nakuha gamit ang isang Zeiss LSM 900 confocal microscope.
Ang mga cell ng HEK293T na matatag na nagpapahayag ng mito-miniSOG ay na-seeded sa isang density ng humigit-kumulang 30% sa 15 cm na mga pinggan.Pagkalipas ng 48 oras, kapag naabot ang ~80% na kumpol, ang mga cell ay hinugasan ng isang beses gamit ang PBS, na pinatuburan ng 1 mM Probe 3 sa sariwang buffer ng HBSS sa loob ng 1 oras sa 37°C at pagkatapos ay iluminado ng isang asul na LED sa loob ng 10 minuto sa silid. temperatura..Pagkatapos nito, ang mga cell ay hugasan ng dalawang beses gamit ang PBS, na-scrap at muling sinuspinde sa malamig na PBS buffer na naglalaman ng EDTA-free protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).Ang mga cell ay na-lysed sa pamamagitan ng pag-sonicate ng tip sa loob ng 1 minuto (1 segundo sa at 1 segundo sa 35% amplitude).Ang nagresultang timpla ay na-centrifuge sa 15,871 xg para sa 10 min sa 4 ° C upang alisin ang mga labi, at ang supernatant na konsentrasyon ay nababagay sa 4 mg / mL gamit ang isang BCA protein assay kit (Beyotime, #P0009).Pagsamahin ang 1 ml ng lysate sa itaas na may 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), at 1 mM CuSO4 incubator pag-ikot pataas ng 1 oras sa temperatura ng kuwarto.Pagkatapos ng snap reaction, idagdag ang mixture sa pre-mixed solution (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) sa isang 10 ml glass vial.Ang mga sample ay halo-halong at sentripuged sa 4500 g sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid.Ang mas mababa at itaas na mga solusyon ay itinapon, ang precipitate ay hugasan ng dalawang beses na may 1 ml ng methanol at sentripuged sa 15871 × g para sa 5 min sa 4 ° C.Magdagdag ng 1 ml ng 8 M urea (Aladdin, no. U111902) sa 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) upang matunaw ang namuo.Ang mga sample ay na-reconstituted na may 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 sa 25 mM ABC) sa loob ng 40 minuto sa 55°C na sinundan ng pagdaragdag ng 15 mM na sariwang iodoacetamide (Sangon, #A600539) sa temperatura ng silid sa dilim.Alkylation sa loob ng 30 minuto..Ang isang karagdagang 5 mM dithiothreitol ay idinagdag upang ihinto ang reaksyon.Maghanda ng humigit-kumulang 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) para sa bawat sample sa pamamagitan ng paghuhugas ng 3 beses gamit ang 1 ml PBS.Ang solusyon sa itaas na proteome ay diluted na may 5 ml PBS at incubated na may pre-washed NeutrAvidin agarose beads para sa 4 na oras sa room temperatura.Ang mga kuwintas ay pagkatapos ay hugasan ng 3 beses na may 5 ml PBS na naglalaman ng 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 beses na may 5 ml PBS na naglalaman ng 1M urea, at 3 beses na may 5 ml ddH2O.Pagkatapos ay inani ang mga kuwintas sa pamamagitan ng centrifugation at muling sinuspinde sa 200 μl ng 25 mM ABC na naglalaman ng 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) at 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize magdamag sa 37°C na may pag-ikot.Ang reaksyon ay itinigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng formic acid (Thermo, # A117-50) hanggang ang pH ay umabot sa 2-3.Ang mga kuwintas ay hugasan ng 3 beses na may 1 ml ng PBS na naglalaman ng 0.2% SDS, 3 beses na may 1 ml ng PBS na naglalaman ng 1 M urea, at pagkatapos ay 3 beses na may 1 ml ng distilled water.Ang binagong peptides ay pinakawalan ng light lysis (365 nm) sa loob ng 90 min gamit ang 200 μl ng 70% MeOH.Pagkatapos ng centrifugation, ang supernatant ay nakolekta.Ang mga kuwintas ay pagkatapos ay hugasan ng isang beses na may 100 μl ng 70% MeOH at ang mga supernatant ay pinagsama.Ang mga sample ay pinatuyo sa isang Speedvac vacuum concentrator at nakaimbak sa -20°C hanggang sa pagsusuri.
Upang matukoy at mabilang ang singlet oxygen modified peptides, ang mga sample ay muling natunaw sa 0.1% formic acid at 1 μg ng peptides ay nasuri gamit ang isang Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer na nilagyan ng nano ESI source mula sa Tune at Xcalibur mula sa vendor software 4.3.Ang mga sample ay pinaghiwalay sa isang 75 µm × 15 cm na panloob na naka-pack na capillary column na may 3 µm C18 na materyal (ReproSil-pur, #r13.b9.) at nakakonekta sa isang EASY-nLC 1200 UHPLC system (Thermo).Ang mga peptide ay pinaghiwalay ng linear na 95 minutong gradient chromatography mula sa 8% solvent B hanggang 50% solvent B (A = 0.1% formic acid sa tubig, B = 0.1% formic acid sa 80% acetonitrile), pagkatapos ay linearly na tumaas sa 98% B min. sa 6 min sa rate ng daloy na 300 nl/min.Ang Orbitrap Fusion Lumos ay kumukuha ng data nang halili sa pagitan ng buong MS scan at MS2 scan depende sa data.Ang sputtering boltahe ay nakatakda sa 2.1 kV at ang temperatura ng ion transport capillary ay 320°C.Ang MS spectra (350-2000 m/z) ay nakolekta na may resolusyon na 120,000, AGC 4 × 105, at isang maximum na oras ng pag-input na 150 ms.Ang 10 pinakakaraniwang multiply charged precursors sa bawat buong pag-scan ay pinaghiwa-hiwalay gamit ang HCD na may normalized na collision energy na 30%, quadrupole isolation window na 1.6 m/z, at isang setting ng resolution na 30,000.Isang target ng AGC para sa tandem mass spectrometry gamit ang 5×104 at maximum na oras ng pag-input na 150 ms.Ang dynamic na exception ay nakatakda sa 30 segundo. Ang mga hindi nakatalagang ion o ang mga may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS. Ang mga hindi nakatalagang ion o ang mga may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ at >7+ были отклонены для МС/МС. Ang mga hindi nakatalagang ion o ion na may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ at >7+ были отклонены для МС/МС. Ang hindi tinukoy na mga ion o ion na may mga singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS.
Ang raw data ay pinoproseso gamit ang FragPipe computing platform batay sa MSFragger.Ang mga mass bias at kaukulang amino acid ay natukoy gamit ang isang bukas na algorithm ng paghahanap na may precursor mass tolerance na -150 hanggang 500 Da.Ang mga binagong peptide ay nakilala pagkatapos gamit ang mga pagbabago sa histidine na may mass gain na +229.0964 at +247.1069 Da sa PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ang mga cell na matatag na nagpapahayag ng fused miniSOG gene ay nilagyan ng 6 cm na mga pinggan.Sa pag-abot sa ~80% na kumpol, ang mga cell ay hinugasan ng isang beses gamit ang HBSS (Gibco, #14025092), pagkatapos ay natupok ng mga chemical probes sa HBSS sa loob ng 1 oras sa 37°C at pinailaw ng asul na ilaw.10W LED sa loob ng 20 minuto sa temperatura ng kuwarto.Upang matukoy kung anong uri ng reactive oxygen species ang kasangkot sa PDPL, 0.5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ay idinagdag sa mga cell bilang mga pandagdag.Pagkatapos ng paghuhugas ng malamig na PBS, ang mga cell ay nasimot, nakolekta sa 1.5 ml centrifuge tubes, at sonicated na may tip para sa 1 min sa 200 μl ng PBS na may 1x protease inhibitor na walang EDTA (1 s at 1 s nang walang, amplitude 35%).Ang nagresultang timpla ay na-centrifuge sa 15,871 × g para sa 10 min sa 4 ° C at ang supernatant na konsentrasyon ay nababagay sa 1 mg / mL gamit ang isang BCA protein assay kit.Humigit-kumulang 50 µl ng lysate sa itaas ay natupok ng 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, at 1 mM CuSO4 sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid na may pag-ikot mula sa ibaba hanggang sa itaas.Matapos ang reaksyon ng pag-click, ang pag-ulan na may acetone ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 250 μl ng pre-chilled acetone sa mga sample, incubating sa -20 ° C para sa 20 min at centrifuging sa 6010 × g para sa 10 min sa 4 ° C.Kolektahin ang pellet at pakuluan sa 50 µl ng 1x Laemmli's buffer sa loob ng 10 min sa 95 °C.Ang mga sample ay sinuri sa SDS-PAGE na mahahabang gel at na-visualize gamit ang Bio-rad ChemiDoc MP Touch imaging system na may Image Lab Touch software.
Ang pagpapahayag at paglilinis ng recombinant na miniSOG-6xHis na protina ay isinagawa tulad ng naunang inilarawan.Sa madaling sabi, ang mga E. coli BL21(DE3) cells (TransGen, #CD701-02) ay binago ng pET21a-miniSOG-6xHis at ang expression ng protina ay na-induce ng 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Pagkatapos ng cell lysis, ang mga protina ay dinalisay gamit ang Ni-NTA agarose beads (MCE, no. 70666), na-dialyze laban sa PBS, at nakaimbak sa –80°C.
Para sa antibody-based in vitro label proximity assay, paghaluin ang 100 μM purified miniSOG, 1 mM probe 3, at 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) sa PBS sa kabuuang dami ng reaksyon na 50 μl..Ang pinaghalong reaksyon ay na-irradiated ng asul na LED light para sa 0, 2, 5, 10, at 20 min sa temperatura ng silid.Ang halo ay natupok ng 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, at 1 mM CuSO4 sa loob ng 1 h sa temperatura ng silid sa isang pataas na motion shaker.Pagkatapos ng snap reaction, magdagdag ng 4x Laemmli's buffer nang direkta sa pinaghalong at pakuluan sa 95°C sa loob ng 10 min.Nasuri ang mga sample sa mga gel ng SDS-PAGE at sinuri ng western blotting na may streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Ang isang histidine na naglalaman ng synthetic peptide na may C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ay ginamit upang pag-aralan ang kalapit na peptide na nakabatay sa in vitro labeling.Sa assay na ito, ang 100 μM purified miniSOG, 10 mM probe 3 at 2 μg / ml synthetic peptide ay pinaghalo sa PBS sa isang kabuuang dami ng reaksyon na 50 μl.Ang pinaghalong reaksyon ay na-irradiated ng asul na LED na ilaw sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid.Ang isang microliter ng sample ay nasuri gamit ang isang LC-MS system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer na may MassLynx spectrum analysis software).
Ang mga cell ng HEK293T na matatag na nagpapahayag ng miniSOG fusion gene ay na-seed sa 10 cm na mga pinggan para sa mga linya na may iba't ibang organelle localization (Mito, ER, Nucleus) at 15 cm na mga pinggan para sa mga linya ng Parkin-miniSOG at BRD4-miniSOG.Sa pag-abot sa ~ 90% na kumpol, ang mga cell ay hinugasan nang isang beses gamit ang HBSS, pagkatapos ay natupok ng probe 3 sa HBSS sa loob ng 1 oras sa 37 ° C at naiilaw ng isang 10 W asul na LED sa temperatura ng silid.Para sa non-contact labeling ng Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) na may probe 3 sa HBSS ay idinagdag sa loob ng 1 oras sa 37°C.Ang cell lysis, click chemistry, reduction at alkylation na mga hakbang ay pareho sa inilarawan sa itaas, maliban na ang 2 mg ng lysate ay idinagdag at biotin PEG3 azide ang ginamit sa click reaction sa halip na photodegradable biotin azide.Pagkatapos ng pagpapayaman, ang mga kuwintas ay hugasan ng 3 beses na may 5 ml ng PBS na naglalaman ng 0.2% SDS, 3 beses na may 5 ml ng PBS na naglalaman ng 1 M urea, at 3 beses na may 5 ml ng PBS.Pagkatapos nito, ang 2 μg trypsin ay idinagdag sa 300 μl 25 mM ABC na naglalaman ng 1 M urea upang i-cleave ang protina magdamag sa 37 ° C.Ang reaksyon ay itinigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng formic acid hanggang sa maabot ang pH na 2-3.Pagkatapos ng trypsinization sa beads, ang peptide solution ay na-desalted gamit ang isang SOLAµ HRP column (Thermo, #60209-001) at pinatuyo sa isang Speedvac vacuum concentrator.Ang mga peptide ay muling natunaw sa 0.1% formic acid at 500 ng ng mga peptides ay nasuri gamit ang isang Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer na nilagyan ng nano-ESI source na inilarawan sa itaas.Ang mga peptide ay pinaghiwalay sa komersyal na RP-HPLC precolumns (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) at analytical na RP-HPLC na mga column (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), na parehong puno ng 2 μm.gradient mula 8% hanggang 35% ACN sa loob ng 60 minuto, pagkatapos ay linearly na tumaas sa 98% B sa loob ng 6 na minuto sa rate ng daloy na 300 Nl/min.Ang MS spectra (350-1500 m/z) ay nakolekta na may resolusyon na 60,000, AGC 4 × 105, at isang maximum na oras ng pag-input na 50 ms.Ang mga napiling ion ay sunud-sunod na pinaghiwa-hiwalay ng HCD sa 3 s cycle na may normalized na collision energy na 30%, isang quadrupole isolation window na 1.6 m/z, at isang resolution na 15000. Isang 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC target at isang maximum na oras ng pag-iniksyon. ng 22 ms ang ginamit.Ang dynamic na pagbubukod ay nakatakda sa 45 segundo. Ang mga hindi nakatalagang ion o ang mga may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS. Ang mga hindi nakatalagang ion o ang mga may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ at >7+ были отклонены для МС/МС. Ang mga hindi nakatalagang ion o ion na may singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ at >7+ были отклонены для МС/МС. Ang hindi tinukoy na mga ion o ion na may mga singil na 1+ at >7+ ay tinanggihan para sa MS/MS.
Ang mga hakbang sa paghahanda ng sample hanggang sa pagpapayaman ng NeutrAvidin beads ay pareho sa pagsusuri ng LC-MS/MS na inilarawan sa itaas.Humigit-kumulang 50 μg ng lysate ang ginamit bilang input para sa pag-load ng control at 2 mg ng lysate ang ginamit para sa mga reaksyon ng pag-click.Pagkatapos ng pagpapayaman at paghuhugas ng neutravidin, ang mga nakagapos na protina ay na-eluted sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 50 μl ng Laemmli's buffer sa agarose resin beads at kumukulo sa 95° C. sa loob ng 5 minuto.Ang control load input at bead enriched sample ay sinuri ng SDS-PAGE at inilipat sa PVDF membranes (Millipore, #ISEQ00010) sa pamamagitan ng karaniwang Western blot na pamamaraan.Ang mga lamad ay hinarangan ng 5% na skim milk (Sangon, #A600669) sa TBS na naglalaman ng 0.1% tween-20 (TBST) at incubated nang sunud-sunod na may pangunahin at pangalawang antibodies.Ang mga pangunahing antibodies ay natunaw ng 1: 1000 sa 5% na skim milk sa TBST at natupok nang magdamag sa 4 ° C.Ang mga pangalawang antibodies ay ginamit sa isang ratio na 1: 5000 at incubated para sa 1 oras sa temperatura ng silid.Ang mga lamad ay na-visualize ng chemiluminescence gamit ang Chemidoc MP imaging system.Ang lahat ng hindi pinutol na pag-scan ng mga blots at gel sa figure ay ipinakita bilang raw data.
Ang mga pangunahing antibodies na ginamit sa pag-aaral na ito ay kinabibilangan ng rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), rabbit anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), rabbit anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), rabbit anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), mouse anti-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), mouse anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), rabbit anti -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antibody sa CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antibody sa DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antibody sa PSMC4 (ABclonal, #A2505), rabbit anti-A2505 DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).Ang mga antibodies na ito ay ginamit sa isang 1:1000 dilution sa 5% skim milk sa TBST.Ang pangalawang antibodies na ginamit sa pag-aaral na ito ay kinabibilangan ng anti-rabbit IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) sa isang 1:5000 dilution.
Upang higit pang maimbestigahan kung nakikipag-ugnayan ang BRD4 sa SFPQ, ang mga stable na HEK293T at BRD4-miniSOG na mga cell na overexpressing HEK293T ay nilagyan ng 10 cm na pinggan.Ang mga cell ay hugasan ng malamig na PBS at na-lysed sa 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) na may EDTA-free protease inhibitor sa loob ng 30 minuto sa 4 ° C.Pagkatapos nito, ang mga lysate ay nakolekta sa 1.5 ml centrifuge tubes at centrifuge sa 15,871 xg para sa 10 min sa 4 ° C.Ang supernatant ay na-harvest at incubated na may 5 µg ng anti-V5 na may label na mouse monoclonal antibody (CST, #80076) magdamag sa 4°C.Hugasan ang humigit-kumulang 50 µl ng protina A/G magnetic beads (MCE, #HY-K0202) nang dalawang beses gamit ang PBS na naglalaman ng 0.5% Tween-20.Pagkatapos ang mga cell lysates ay natupok ng magnetic beads sa loob ng 4 na oras sa 4 ° C na may pag-ikot mula sa ibaba hanggang sa itaas.Pagkatapos ang mga kuwintas ay hugasan ng apat na beses na may 1 ml ng PBST buffer at pinakuluan sa 95 ° C sa loob ng 5 min.Nasuri ang mga sample sa mga SDS-PAGE na gel at inilipat sa mga lamad ng PVDF gamit ang mga karaniwang pamamaraan ng Western blot.Ang mga lamad ay naharang sa 5% na skim milk sa TBST at sunud-sunod na natupok sa pangunahin at pangalawang antibodies.Ang Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) ay ginamit sa ratio na 1:1000 sa 5% na skim milk sa TBST at natupok nang magdamag sa 4°C.Ang anti-rabbit IgG ay ginamit sa isang ratio na 1: 5000 at incubated para sa 1 oras sa temperatura ng silid.Ang mga lamad ay na-visualize ng chemiluminescence gamit ang Chemidoc MP imaging system.
Ang lahat ng mga istrukturang ginamit para sa pagsusuri ng Solvent Accessible Surface Area (SASA) ay nakuha mula sa Protein Data Bank (PDB)52 o ang AlphaFold Protein Structure Database53.Ang ganap na SASA ay kinakalkula para sa bawat nalalabi gamit ang FreeSASA program.Tanging kumpleto at hindi malabo na data ng SASA para sa may label na histidine at mga kapitbahay nito ang ginamit upang makuha ang ibig sabihin ng SASA para sa bawat istraktura.Ang kamag-anak na solvent accessibility (RSA) para sa bawat histidine ay kinakalkula sa pamamagitan ng paghati sa ganap na halaga ng SASA sa empirical maximum na posibleng residue surface area na magagamit sa solvent.Ang lahat ng histidine ay inuri bilang nakatago kung ang ibig sabihin ng RSA ay mas mababa sa 20%, kung hindi man ay nakalantad56.
Ang mga raw file na nakuha sa DDA mode ay hinanap gamit ang Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) sa naaangkop na SwissProt verified protein database na naglalaman ng mga karaniwang contaminant.Ang mga peptides ay nangangailangan ng kumpletong trypsin na may dalawang nawawalang cleavage site, carbamoyl methylation bilang isang nakapirming pagbabago at methionine oxidation bilang isang dinamikong pagbabago.Ang precursor at fragment weight tolerances ay itinakda sa 10 ppm at 0.02 Da (MS2 Orbitrap), ayon sa pagkakabanggit. Inalis ang mga contaminant hit, at na-filter ang mga protina upang makakuha ng maling rate ng pagtuklas na <1%. Inalis ang mga contaminant hit, at na-filter ang mga protina upang makakuha ng maling rate ng pagtuklas na <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного %. Inalis ang mga contaminant hit at na-filter ang mga protina para magbigay ng false detection rate na <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаруже%. Inalis ang mga contaminant hit at na-filter ang mga protina upang makamit ang false positive rate na <1%.Para sa quantitative analysis nang walang paggamit ng mga label, ginamit ang normalized na nilalaman ng protina mula sa tatlong biological na pag-uulit.Ang pagsusuri ng subcellular localization ng protina ay isinagawa gamit ang pagsusuri ng Gene Ontology (GO) mula sa DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 at mga database na pinagsama-sama at nai-publish ng pangkat na Alice Ting.Ang mapa ng bulkan ay nakuha mula kay Perseus (v1.6.15.0). Ang mga pagbabago sa fold ng kasaganaan ng protina ay nasubok para sa istatistikal na kahalagahan gamit ang isang dalawang panig na t-test, at ang mga hit ng protina ay natukoy na may pagbabago sa kasaganaan> 2 (maliban kung nakasaad) at p value <0.05. Ang mga pagbabago sa fold ng kasaganaan ng protina ay nasubok para sa istatistikal na kahalagahan gamit ang isang dalawang panig na t-test, at ang mga hit ng protina ay natukoy na may pagbabago sa kasaganaan> 2 (maliban kung nakasaad) at p value <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Ang mga pagbabago sa fold ng nilalaman ng protina ay nasubok para sa istatistikal na kahalagahan gamit ang isang two-tailed t-test, at ang mga tugma ng protina ay nakilala sa pagbabago ng nilalaman>2 (maliban kung nabanggit) at ap value <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 p 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagbabago sa fold sa nilalaman ng protina ay nasubok gamit ang isang two-tailed t-test, at ang mga tugma ng protina ay tinutukoy para sa mga pagbabago sa nilalaman> 2 (maliban kung ipinahiwatig) at p-values ​​​​<0.05.Ang pagsusuri sa pakikipag-ugnayan ng protina ay isinagawa gamit ang pagsusuri ng GO kasama ang database ng String.
Tatlong biological replicates ang isinagawa na may katulad na mga resulta.Ang pagtatasa ng istatistika ay ginawa gamit ang GraphPad Prism (GraphPad software) at ang mga bulkan ay nabuo gamit ang Perseus (v1.6.15.0).Upang ihambing ang dalawang grupo, ang mga p-value ay natukoy gamit ang t-test ng Mag-aaral na may dalawang buntot.Ang mga singleton protein lamang na natukoy nang hindi bababa sa dalawang beses sa eksperimentong grupo ang kasama sa mga plot ng bulkan, at ang kaukulang mga nawawalang halaga sa control group ay pinalitan ng Perseus mula sa isang normal na pamamahagi upang ang p-value ay makalkula.Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.Sa proteomic na pagsusuri para sa istatistikal na pagsusuri, ang kasaganaan ng mga protina na lumitaw sa hindi bababa sa dalawang biological replicates ay napanatili.Ang mga pamamaraan ng istatistika ay hindi ginamit upang paunang matukoy ang laki ng sample.Ang mga eksperimento ay hindi random.Ang mga mananaliksik ay hindi bulag sa mga gawain sa panahon ng eksperimento at pagsusuri ng mga resulta.
Para sa karagdagang impormasyon sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstract ng Ulat sa Pananaliksik sa Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.
Ang data ng mass spectrometry na nakuha sa pag-aaral na ito ay isinumite sa ProteomeXchange Consortium sa pamamagitan ng iProX57 partner repository sa ilalim ng dataset ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.Ang artikulong ito ay nagbibigay ng orihinal na data.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pagkilala sa kapitbahayan: gamit ang proximity-dependent biotinylation upang makilala ang mga complex ng protina at mga organel ng mapa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pagkilala sa kapitbahayan: gamit ang proximity-dependent biotinylation upang makilala ang mga complex ng protina at mga organel ng mapa.Gingras, AS, Abe, KT at Raut, B. Pamilyar sa kapaligiran: gamit ang biotinylation na umaasa sa proximity upang makilala ang mga complex ng protina at mga organel ng mapa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并细。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pag-unawa sa kapitbahayan: gamitin ang pag-asa ng kapitbahayan sa biyolohikal na buhay.Gingras, AS, Abe, KT at Raut, B. Pag-unawa sa kalapitan: paglalarawan ng mga complex ng protina at pagmamapa ng mga organelle gamit ang biotinylation na umaasa sa proximity.Kasalukuyan.Aking opinyon.Kemikal.biology 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Pagma-map sa microenvironment sa pamamagitan ng paglilipat ng Dexter energy sa immune cells.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Nakikita ng dalawang-proteome scale network ang pag-remodeling na partikular sa cell ng interaksyon ng tao.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).