Balita

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang mga selula ng kanser ay nagbago ng iba't ibang mga mekanismo upang mapagtagumpayan ang cellular stress at magpatuloy sa pag-unlad.Ang protina kinase R (PKR) at ang protein activator nito (PACT) ay ang mga paunang tumugon na sumusubaybay sa iba't ibang mga signal ng stress na humahantong sa pagsugpo sa paglaganap ng cell at apoptosis.Gayunpaman, ang regulasyon ng landas ng PACT-PKR sa mga selula ng kanser ay nananatiling hindi alam.Dito, natagpuan namin na ang mahabang non-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ay direktang kasangkot sa pagsugpo sa landas ng PACT-PKR at nagtataguyod ng paglaganap ng selula ng kanser.Gamit ang malakihang functional screening ng CRISPRi 971 cancer-associated lncRNA, nalaman namin na ang DARS-AS1 ay nauugnay sa makabuluhang pinahusay na paglaganap ng cancer cell.Samakatuwid, pinipigilan ng DARS-AS1 knockout ang paglaganap ng cell at itinataguyod ang cancer cell apoptosis sa iba't ibang mga linya ng selula ng kanser sa vitro at makabuluhang binabawasan ang paglaki ng tumor sa vivo.Sa mekanikal, ang DARS-AS1 ay direktang nagbubuklod sa domain ng activation ng PACT at pinipigilan ang pakikipag-ugnayan ng PACT-PKR, sa gayon binabawasan ang pag-activate ng PKR, eIF2α phosphorylation, at pinipigilan ang apoptotic cell death.Sa klinikal na paraan, ang DARS-AS1 ay malawak na ipinahayag sa maraming mga cancer, at ang sobrang pag-expression ng lncRNA na ito ay nagpapahiwatig ng isang mahinang pagbabala.Ang pag-aaral na ito ay nagpapaliwanag ng regulasyong tukoy sa cancer ng PACT-PKR pathway ng DARS-AS1 lncRNA at nagbibigay ng isa pang target para sa pagbabala at paggamot ng cancer.
Ang kakayahang umangkop sa stress ay isang mahalagang katangian ng kaligtasan ng selula ng kanser at paglaganap.Ang mabilis na paglaganap at metabolic hallmarks ng cancer ay pinakamataas sa malupit na microenvironment—pagkawala ng nutrient, hypoxia, at mababang pH—na maaaring mag-trigger ng cell death signaling pathways.Ang dysregulation ng mga stress-sensitive genes tulad ng p535, heat shock proteins 6, 7, KRAS8, 9, at HIF-110, 11, 12, 13 ay madalas na sinusunod sa cancer, sa gayon ay hinaharangan ang apoptosis at nagpo-promote ng kaligtasan.
Ang protina kinase R (PKR) ay isang mahalagang sensor ng stress at subunit kinase ng eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), isang translational regulator na nag-uugnay sa cellular stress sa cell death.Ang PKR ay orihinal na nakilala bilang isang antiviral na protina sa pamamagitan ng pagtuklas ng isang dayuhang double-stranded RNA (dsRNA).Sa pag-activate, ang PKR ay nag-phosphorylate ng eIF2α upang pigilan ang viral at cellular protein synthesis14,15,16.Ang PACT (PKR activator protein) ay nakilala bilang ang unang PKR activator protein sa kawalan ng dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Sa pamamagitan ng direktang pakikipag-ugnayan sa PKR, inililipat ng PACT ang iba't ibang stress (serum starvation, peroxide o arsenite treatment) sa PKR at downstream signaling pathways.Bilang karagdagan sa eIF2α phosphorylation, ang PACT-mediated PKR activation ay nag-trigger ng iba't ibang mga kaganapan na nauugnay sa stress response, kabilang ang binagong redox status sa pamamagitan ng PI3K/Akt24 pathway, pinahusay na pagsusuri sa pinsala sa DNA sa pamamagitan ng p5325,26 at NF-κB27,28 Regulates transcription, 29. Dahil sa kanilang kritikal na papel sa pagtugon sa stress, paglaganap, apoptosis at iba pang mga pangunahing proseso ng cellular, ang PKR at PACT ay nangangako ng mga therapeutic target para sa maraming sakit, lalo na ang cancer30,31,32,33.Gayunpaman, sa kabila ng pleiotropic functional at biological na kahalagahan na ito, ang regulasyon ng aktibidad ng PACT/PKR sa mga selula ng cancer ay nananatiling mailap.
Ang mga lncRNA ay mga transcript na mas malaki sa 200 nucleotides na walang potensyal na pag-coding ng protina.Dahil ang mga cutting-edge na buong genome sequencing na mga proyekto ay nakilala ang libu-libong lncRNAs, 35,36 maraming pagsisikap ang ginawa upang ipaliwanag ang kanilang mga biological function.Ang isang lumalagong katawan ng pananaliksik ay nagpakita na ang mga lncRNA ay kasangkot sa maraming biological na proseso37 kabilang ang regulasyon ng X-chromosome inactivation38,39, imprinting40, transcription41,42, pagsasalin43 at maging ang paglaki ng cancer44,45,46,47.Iniulat ng mga pag-aaral na ito na maraming lncRNA ang kasangkot sa landas ng PACT/PKR.Ang isang naturang pag-aaral ay nagpakita na ang lncRNA ASPACT ay humadlang sa transkripsyon ng PACT at nadagdagan ang nuclear retention ng PACT mRNA.Ipinakita ng iba pang mga pag-aaral na ang lncRNA nc886 ay nagbubuklod sa PKR at pinipigilan ang phosphorylation nito49,50.Sa ngayon, ang lncRNA na kumokontrol sa PACT-mediated PKR activation ay hindi naiulat.
Ang Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ay nakilala bilang isang oncogenic lncRNA51,52,53,54.Sa pamamagitan ng regulasyon ng miP-194-5p53, miP-12952 at miP-532-3p51, ang DARS-AS1 ay ipinakita upang itaguyod ang paglaki ng malinaw na cell renal cell carcinoma, thyroid carcinoma at non-small cell lung carcinoma, ayon sa pagkakabanggit.Natagpuan din ni Tong at mga kasamahan na ang DARS-AS1 ay nagtataguyod ng pag-unlad ng myeloma sa pamamagitan ng pagpapanatili ng katatagan ng protina 39 (RBM39) RNA-binding motif.Gayunpaman, walang mga pag-aaral na isinagawa kung ang lncRNA na ito ay kasangkot sa regulasyon ng pag-activate ng PACT-PKR at ang tugon ng stress ng mga selula ng kanser.
Dito, nagsagawa kami ng malakihang loss-of-function na screen gamit ang CRISPRi system at natukoy na ang DARS-AS1 lncRNA ay nagtataguyod ng paglaganap ng ilang uri ng cancer cells.Bilang karagdagan, natukoy namin ang isang pangunahing mekanismo: ang DARS-AS1 ay direktang nagbubuklod sa PACT, pinipigilan ang pagbubuklod ng PACT at PKR, pinipigilan ang phosphorylation ng eIF2α, isang mas mababang substrate ng PKR, at sa huli ay pinipigilan ang apoptotic cell death.Sa konklusyon, ipinapakita ng aming trabaho ang DARS-AS1 lncRNA bilang isang regulator ng landas ng PACT-PKR at isang potensyal na target para sa paggamot at pagbabala ng kanser.
Natukoy ng malawak na genomic profiling studies ang daan-daang lncRNA na nauugnay sa cancer.Gayunpaman, ang kanilang function ay nananatiling higit na hindi alam56.Upang matukoy ang mga promising na kandidato ng lncRNA na kasangkot sa pag-unlad ng cancer, nagsagawa kami ng loss-of-function na screen para sa pinababang paglaganap sa SW620 colorectal cancer cell line gamit ang CRISPRi system (Fig. 1a).Ang kakaibang katangian ng SW480 at SW620 colon cancer cell lines ay ang mga ito ay nagmula sa pangunahin at pangalawang tumor sa isang pasyente.Nagbibigay ito ng mahalagang paghahambing para sa pag-aaral ng mga pagbabago sa genetic sa pag-unlad ng advanced na colon cancer.Samakatuwid, sinuri namin ang mga transcriptomes ng colorectal cancer cell lines (SW480 at SW620) gamit ang RNA sequencing at nakolekta ang ilang potensyal na functional lncRNAs mula sa nai-publish na panitikan.Batay sa mga resultang ito, nagdisenyo kami ng isang pooled sgRNA library na naglalaman ng 7355 sgRNA oligos na nagta-target sa 971 na cancer-associated lncRNAs at 500 untargeted sgRNA oligos para sa isang negatibong kontrol (Karagdagang Data 1).
Schematic na representasyon ng screening gamit ang CRISPRi system.b sgRNA enrichment pagkatapos ng screening.Ang pahalang na may tuldok na linya ay kumakatawan sa log2 (fold change) = ±0.58.Ang patayong tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng p value = 0.05.Ang mga itim na tuldok ay kumakatawan sa hindi target na sgRNA (itinalaga bilang NC).Ang mga pulang tuldok ay mga sgRNA na nagta-target sa DARS-AS1.Ang mga asul na tuldok ay mga sgRNA na nagta-target sa LINC00205, isang naunang inilarawan na oncogenic lncRNA.fold change = (normalized reading, day 17)/(normalized reading, day 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown ay humadlang sa paglaki ng cell.Ang mga error bar ay kumakatawan sa ± standard deviation ng tatlong eksperimento.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 two-tailed Student's t-test.d DARS-AS1 expression sa mga tumor (TCGA dataset).em Expression ng DARS-AS1 sa mga nakapares na normal at tumor sample mula sa mga pasyenteng may BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, at COAD, ayon sa pagkakabanggit (TCGA dataset).Ang mga p-value ay nakuha gamit ang ipinares na two-tailed Student's t-test.
Matapos itayo ang plasmid at i-package ang lentivirus, inilipat namin ang dCas9-SW620 colorectal cancer cell line kasama ang library sa itaas sa apat na independiyenteng mga eksperimento sa impeksyon.Ang multiplicity ng impeksyon (MOI) para sa mga impeksyong ito ay 0.1-0.3, na nagpapahiwatig na ang bawat cell ay maaari lamang ilipat sa isang sgRNA.Pagkatapos ng 18 araw ng in vitro culture, ang enrichment profile ng mga target na sgRNA ay bumaba o tumaas pagkatapos ng screening, habang ang bilang ng mga non-targeted control oligonucleotides ay nanatiling medyo hindi nagbabago kumpara sa pre-screening profile, na nagpapahiwatig na ang aming target ay may mataas na screen-specific. aklatan.kanin.1b at karagdagang talahanayan 1). Ang LINC00205, na dati nang naiulat na nagsusulong ng kanser sa baga at pag-unlad ng kanser sa atay58,59,60, ay na-screen out (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), na nagpapatunay sa pagiging maaasahan ng screening na ito (Fig. 1b). Ang LINC00205, na dati nang naiulat na nagsusulong ng kanser sa baga at pag-unlad ng kanser sa atay58,59,60, ay na-screen out (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), na nagpapatunay sa pagiging maaasahan ng screening na ito (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). Ang LINC00205, na dating naiulat na nagsusulong ng pag-unlad ng kanser sa baga at kanser sa atay58,59,60, ay hindi kasama (log2 (pagbabago ng tiklop) <-0.58, p-value <0.05), na nagpapatunay sa katatagan ng screening na ito (Fig. 1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). Ang LINC00205, na dating naiulat na nagsusulong ng pag-unlad ng kanser sa baga at atay58,59,60, ay hindi kasama (log2 (pagbabago ng tiklop) <-0.58, p-value <0.05), na nagpapatunay sa katatagan ng screening na ito (Fig. 1b).
Sa lahat ng nasubok na lncRNA, na-screen din ang DARS-AS1, na ang tatlong magkakaugnay na sgRNA oligonucleotides ay makabuluhang nabawasan pagkatapos ng 18 araw ng kultura, na nagmumungkahi na ang pagbagsak ng lncRNA na ito ay nagresulta sa pagbawas ng paglaganap ng cancer (Fig. 1b).Ang resulta na ito ay karagdagang suportado ng pagsusuri ng MTS sa mga colorectal cancer cells na nagpapakita na ang rate ng paglago ng DARS-AS1 knockdown cells ay nahahati lamang kumpara sa mga control cell (Larawan 1c) at naaayon sa mga nakaraang ulat ng maraming iba pang mga uri ng cancer.: clear cell kidney cancer, thyroid cancer at non-small cell lung cancer51,52,53,55.Gayunpaman, ang pag-andar nito at mga mekanismo ng molekular sa colorectal cancer ay nananatiling hindi ginalugad.Samakatuwid, pinili namin ang lncRNA na ito para sa karagdagang pag-aaral.
Upang pag-aralan ang expression ng DARS-AS1 sa mga pasyente, komprehensibong sinuri namin ang 10,327 na mga sample ng tumor mula sa proyektong Cancer Genome Atlas (TCGA).Ipinapakita ng aming mga resulta na ang DARS-AS1 ay malawak na ipinahayag at makabuluhang na-upregulated sa mga malulusog na selula sa iba't ibang mga bukol, kabilang ang colon adenocarcinoma (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC), at renal papillary cell carcinoma (KIRP)..Napakakaunti (Larawan 1d at Karagdagang Larawan. 1a, b). Ang pagsusuri ng mga nakapares na malusog/tumor sample ay higit pang nakumpirma ang isang makabuluhang mas mataas na pagpapahayag ng DARS-AS1 sa mga tumor ng pantog urothelial carcinoma (BLCA), kidney renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), at colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e–m) . Ang pagsusuri ng mga nakapares na malusog/tumor sample ay higit pang nakumpirma ang isang makabuluhang mas mataas na pagpapahayag ng DARS-AS1 sa mga tumor ng pantog urothelial carcinoma (BLCA), kidney renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), at colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e–m) .Ang pagsusuri ng mga nakapares na malusog/tumor sample ay nakumpirma rin ang makabuluhang mas mataas na pagpapahayag ng DARS-AS1 sa bladder urothelial carcinoma (BLCA), clear cell renal at renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) na mga bukol., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometrial carcinoma of the corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma of the lung (LUAD), hepatocellular carcinoma of the liver (LIHC), papillary cell carcinoma of the kidney (KIRP), at adenocarcinoma of the colon (COAD) (p value < 0.05) (Larawan 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (Lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （ucec） ， 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 细胞癌 （lihc） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） 和结肠腺癌 （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌.癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Ang pagsusuri ng mga malusog/tumor na ipinares na sample ay higit pang sumuporta sa papel ng DARS-AS1 sa bladder urothelial carcinoma (BLCA), clear cell renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), at lung squamous cell carcinoma (LUSC) na mga bukol.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expression sa corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), at colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Larawan 1e -m).Kung sama-sama, ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang DARS-AS1 ay malawak at lubos na ipinahayag sa iba't ibang mga kanser.
Dahil ang DARS-AS1 at DARS (ang gene na naka-encode sa antisense strand) ay nagbabahagi ng parehong tagataguyod at matatagpuan sa tabi ng isa't isa, dinisenyo namin ang shRNA upang partikular na i-knockdown ang DARS-AS1 ngunit hindi ang DARS (Karagdagang Fig. 2a,b at Karagdagang Talahanayan 2) .Bilang karagdagan sa SW620, gumamit din kami ng tatlong iba pang mga linya ng cell na lubos na nagpapahayag ng DARS-AS1 upang pag-aralan ang pagiging epektibo at pag-andar ng shRNA knockdown (Karagdagang Talahanayan 3).Ang aming mga resulta ay nagpahiwatig na ang lahat ng tatlong shRNA na binuo ay nakakamit ng hindi bababa sa 80% DARS-AS1 na kahusayan sa knockdown na may maliit na epekto sa dami ng DARS mRNA (Karagdagang Fig. 2c–f).Bilang karagdagan, nalaman namin na ang DARS-AS1 knockdown kasama ang mga shRNA na ito ay makabuluhang humadlang sa paglaki ng cell sa colorectal cancer cell lines na SW620 (49.7%) at HCT116 (27.7%), breast cancer cell line MBA-MD-231 (53.4%).) at ang HepG2 hepatoma cell line (92.7% na pagbabawas), gayundin ang kanilang kakayahang bumuo ng mga hindi nakakulong sphere (average na pagbabawas ng ~50.8%, 44.6%, 40.7% at 75.7% bawat cell line) (Fig. 2a,b).Sa SW620, ang mga resulta ng colony formation assay ay karagdagang nakumpirma na ang DARS-AS1 shRNA ay makabuluhang humadlang sa paglaganap ng cell na may average na pagbaba ng humigit-kumulang 69.6% (Fig. 2c).
Epekto ng control shRNA at DARS-AS1 shRNA sa cell proliferation (a) at spheroid formation (b) sa SW620, HCT116, MBA-MD-231, at HepG2 cells.c Epekto ng control shRNA at DARS-AS1 shRNA sa pagbuo ng kolonya sa SW620 cells.Paglaganap ng cell (d), pagbuo ng spheroid (e), at pagbuo ng kolonya (f) ng mga cell ng SW620 na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1.Ang data na ipinakita ay ang mean ± standard deviation ng tatlong eksperimento.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, at *** p ≤ 0.001 sa pamamagitan ng two-tailed Student's t-test.
Upang makadagdag sa mga pag-aaral sa pagkawala ng pag-andar, sumunod kaming lumikha ng mga cell ng SW620 na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1 (Karagdagang Fig. 2g).Ang sobrang pagpapahayag ng DARS-AS1 ay makabuluhang nadagdagan ang paglaki ng cell (1.8-tiklop), unachored spheroid formation (1.4-fold), at colony formation (3.3-fold) sa SW620 cells (Fig. 2d–f).Kinumpirma namin ang resultang ito gamit ang isa pang DARS-AS1 na nagpapahayag ng cell line, A549.Ang pinahusay na paglaganap ng cell na ito dahil sa overexpression ng DARS-AS1 ay higit pang naobserbahan sa mga cell ng A549 (Karagdagang Fig. 2h, i at Pandagdag na Talahanayan 3).Pinagsama-sama, ang mga pag-aaral ng pakinabang at pagkawala ay nagpapakita na ang DARS-AS1 ay nagtataguyod ng paglaganap ng selula ng kanser sa vitro.
Upang galugarin ang pinagbabatayan na mekanismo kung saan kinokontrol ng DARS-AS1 ang paglaganap ng cell, nagsagawa kami ng RNA pull-down analysis upang matukoy ang mga potensyal na partner na nagbubuklod ng protina.Ang mga resulta ng RT-qPCR ay nagpakita na ang tungkol sa 86.2% ng DARS-AS1 ay matatagpuan sa cytoplasm ng SW620 cells (Karagdagang Fig. 3a).Ang in vitro na na-transcribe na biotinylated DARS-AS1 o pseudoRNA ay pagkatapos ay incubated na may SW620 cell lysates na sinundan ng paghihiwalay ng SDS-PAGE.Ang kasunod na paglamlam ng pilak ay nagpakita na ang isang natatanging banda (~ 38 kDa) ay makabuluhang pinayaman sa mga sample ng pull ng DARS-AS1 ngunit hindi sa mga sample ng dummy RNA o beads (Fig. 3a).Ang banda na ito ay kinilala bilang isang PKR activating protein (PACT) sa pamamagitan ng mass spectrometry (MS) at higit pang nakumpirma sa pamamagitan ng immunoblotting sa SW620, HCT116, at HepG2 cell lines (Fig. 3a,b).Ang pagpapayaman ng DARS at mga kaugnay na protina ng PACT - PKR at TRBP - ay sinisiyasat din gamit ang pagsusuri sa RNA ng Western blotting (WB).Ang mga resulta ay nagpahiwatig na walang direktang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng DARS-AS1 RNA at ang tatlong protina na ito ay natagpuan (Karagdagang Fig. 3b).Ang tiyak na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng DARS-AS1 at PACT ay karagdagang nakumpirma ng pagsusuri ng RNA immunoprecipitation (RIP), na nagpakita na ang DARS-AS1 ay makabuluhang pinayaman sa mga anti-PACT antibodies ngunit hindi iba pang mga control RNA (Larawan 3c).Upang matukoy kung ang DARS-AS1 ay direktang nakikipag-ugnay sa PACT sa kawalan ng anumang iba pang mga sangkap ng cellular, isang in vitro biolayer interferometry (BLI) assay ay isinagawa gamit ang purified PACT.Ang biotin na may label na DARS-AS1 o dummy RNA ay na-immobilize sa mga biosensor ng streptavidin (SA) at pagkatapos ay na-incubate sa kinetic buffer na naglalaman ng 1 μM PACT.Kapansin-pansin, ang PACT ay mahigpit na nakagapos sa DARS-AS1 (halaga ng KD ~ 26.9 nM), ngunit hindi upang gayahin ang RNA (Larawan 3d).Kung pinagsama-sama, ang mga resultang ito ay nagpapakita ng direktang pakikipag-ugnayan at mataas na pagkakaugnay sa pagitan ng DARS-AS1 at PACT.
Ang RNA pull analysis ay nakilala ang DARS-AS1 na nakikipag-ugnay sa PACT sa SW620 cells.Sa itaas, paglamlam ng pilak ng mga kaugnay na protina.Ang mga mas mababang immunoblots ay isinagawa gamit ang anti-PACT antibody.b RNA pull-down analysis ay isinagawa sa HCT116 (itaas) at HepG2 (ibaba) na mga cell.Ang pagpapayaman ng PACT ay nakita sa pamamagitan ng immunoblotting.Ang cRNA immunoprecipitation (RIP) assays ay isinagawa sa SW620 cells gamit ang ipinahiwatig na mga antibodies.d PACT binding curves sa full-length DARS-AS1 o control RNA ay nakuha gamit ang biolayer interferometry (BLI).Ang RNA ay na-immobilize sa isang streptavidin biosensor.Ang 1 μM PACT ay ginamit upang sukatin ang samahan.Ang e RNA pull assay ay isinagawa gamit ang biotinylated full-length DARS-AS1 o truncated (itaas).Immunoblot na nagpapakita ng PACT na natanggap (ibaba).f Ang purified flagged PACT ay na-incubate ng biotinylated full-length DARS-AS1 o pinutol (tulad ng sa e) para sa in vitro RIP assay.Ang nakuha na RNA ay napatunayan ng RT-qPCR.g Ang kamag-anak na pagkakaugnay ng iba't ibang mga fragment ng RNA para sa PACT ay nakuha gamit ang biolayer interferometry.Para sa pagsusuri, ginamit ang 100 nM RNA at 1 μM RAST.h In vitro RIP assays ay isinagawa gamit ang purified intact o truncated na may label na PACT.Ang nakuha na RNA ay napatunayan ng RT-qPCR.i Rate ng paglaki ng SW620 na mga cell na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1, PACT, o pareho.j Ang sobrang pagpapahayag ng buong haba o pinutol na DARS-AS1 sa SW620 na mga cell ay may iba't ibang epekto sa paglaki ng cell.Ang k Apoptosis ay nakita sa pamamagitan ng immunoblotting na may anti-PARP antibody.l Ang Knockout ng DARS-AS1 ay nagpapahiwatig ng apoptosis ng SW620 na mga cell tulad ng ipinapakita ng daloy ng cytometry.Ang data na ipinakita ay ang mean ± standard deviation ng tatlong eksperimento. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, sa pamamagitan ng two-tailed Student's t test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, sa pamamagitan ng two-tailed Student's t test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ng two-tailed Student's t-test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ng two-tailed Student's t-test.
Pagkatapos ay nakabuo kami ng tatlong biotinylated DARS-AS1 RNA fragment sa pamamagitan ng in vitro transcription upang matukoy ang DARS-AS1 na rehiyon na kinakailangan para sa PACT association (Larawan 3e).Ang mga resulta ng pagsusuri sa RNA ay nagpakita na ang bawat fragment ay maaaring makipag-ugnayan sa PACT, ngunit ang 3′-terminal na rehiyon (384–768 nucleotides na may label na A3) ay nagpakita ng higit sa 1–384 nucleotides na may label na A1) (Fig. 3e).Ang mga magkatulad na resulta ay naobserbahan sa in vitro RIP assay gamit ang recombinant PACT (Larawan 3f).Alinsunod sa mga resultang ito, ang mga eksperimento upang magbigkis ng mga immobilized RNA fragment sa PACT gamit ang BLI ay nagpakita rin na ang PACT ay may mas mataas na pagkakaugnay para sa A3 (384–768 nt) (KD na halaga ng humigit-kumulang 94.6 nM), habang halos walang mga link sa iba pang mga lugar.(Larawan 3d).
Sinuri din namin ang nauugnay na mga nagbubuklod na rehiyon sa PACT.Naglalaman ang PACT ng tatlong functional domain, dalawa sa mga ito ay conserved double-stranded RNA-binding domain (dsRBD) at isang ikatlong domain (designated D3) na gumaganap bilang isang activator ng mga protein interaction.Upang suriin ang kapasidad na nagbubuklod ng lncRNA ng bawat domain, nag-engineer kami ng tatlong mutasyon na nag-alis ng bawat isa sa tatlong domain at nagsagawa ng in vitro RIP assay.Ang aming mga resulta ay nagpakita na ang pagtanggal ng ikatlong domain (D3) ng PACT ay makabuluhang nabawasan ang pakikipag-ugnayan nito sa DARS-AS1 (sa pamamagitan ng 0.11-tiklop kumpara sa buo na PACT) kumpara sa iba pang dalawang mutasyon (Fig. 3h), ipinakita na ang paglabas ng D3 ay nakipag-ugnayan sa DARS.-AC1.Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga resulta na ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng DARS-AS1 at PACT ay maaaring mangyari pangunahin sa pamamagitan ng 3′ dulo ng DARS-AS1 at ang D3 domain ng PACT.
Napansin namin na ang DARS-AS1 ay walang epekto sa PACT expression at ang PACT ay walang epekto sa DARS-AS1 (Karagdagang Fig. 3c).Pagkatapos ay sinuri namin ang epekto ng PACT knockdown sa paglaki ng cell.Kabaligtaran sa DARS-AS1, ang mga kamag-anak na cell ay lumago ng 1.5-3 beses nang mas mabilis kapag ang PACT ay natumba (Karagdagang Fig. 3d).Ang mga resulta ng colony formation assay ay nagpahiwatig na ang mga cell ay nabuo ng 2-3-fold na mga kolonya pagkatapos ng shRNA na paggamot na may PACT (Karagdagang Fig. 3e).Para masubukan kung kinokontrol ng DARS-AS1 ang paglaganap ng cell sa pamamagitan ng PACT, nakabuo kami ng mga SW620 na cell na labis na nagpapahayag ng PACT, DARS-AS1, o pareho.Ang overexpression ng PACT ay nagpakita ng makabuluhang pagsugpo sa paglaganap ng cell (Larawan 3i).Habang ang DARS-AS1 overexpression per se ay makabuluhang nagsulong ng paglaganap ng cell, walang makabuluhang pagkakaiba sa rate ng paglago ng mga cell na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1 at PACT.Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang PACT ay maaaring humadlang sa tumaas na paglaganap na dulot ng DARS-AS1 overexpression.
Dahil ang iba't ibang mga rehiyon ng DARS-AS1 ay may iba't ibang mga kakayahan na nagbubuklod ng PACT, sinisiyasat namin ang kanilang kamag-anak na impluwensya sa paglaganap ng cell sa pamamagitan ng iba't ibang overexpression ng mga fragment ng DARS-AS1.Kung ikukumpara sa iba pang dalawang fragment, ang DARS-AS1 ay na-overexpress sa dulo ng 3′ (384–768 nt), ang pangunahing rehiyon na nauugnay sa PACT sa DARS-AS1, na may pinakamataas na kakayahang pasiglahin ang paglaganap ng cell (Fig. 3j).Ang mga resulta na ito ay nagpapahiwatig ng isang positibong ugnayan sa pagitan ng nagbubuklod na kapasidad at biological function ng DARS-AS1.
Ang PACT ay naiulat na isang pro-apoptotic na protina19.Samakatuwid, sinisiyasat namin ang epekto ng DARS-AS1 sa apoptosis.Tulad ng inaasahan, ang DARS-AS1 knockdown ay makabuluhang nadagdagan ang PARP cleavage sa SW620 cells at nadagdagan ang proporsyon ng annexin V-positive na mga cell sa SW620, HCT116, HepG2, at MBA-MD-231 na mga linya ng cell (Fig. 3k).3).3f-h), na nagpapahiwatig na ang anti-apoptotic na epekto ng DARS-AS1 sa mga selula ng cancer ay kabaligtaran sa apoptosis-inducing function ng PACT.Kung pinagsama, iminumungkahi ng mga resulta na ito na ang mekanismo ng DARS-AS1 oncogenic function ay maaaring sa pamamagitan ng pagsugpo sa PACT function.
Susunod, ginalugad namin ang mga functional na implikasyon ng DARS-AS1-PACT association.Ang PACT ay naiulat na i-activate ang PKR sa pamamagitan ng direktang pakikipag-ugnayan, na kasunod na pinahuhusay ang eIF2α phosphorylation, na nagiging sanhi ng pagtanggal ng pagsasalin at apoptosis17.Una, sinuri namin kung ang DARS-AS1 ay nakakaapekto sa cellular localization ng PACT at PKR.Ang confocal fluorescence microscopy ay nagpakita na ang PACT at PKR ay lubos na na-colocalize sa SW620 cells na may average na Pearson correlation coefficient na 0.72.Samantala, ang sobrang pagpapahayag ng DARS-AS1 ay makabuluhang nabawasan ang PACT at PKR na co-localization (ibig sabihin Pearson correlation coefficient 0.61) (Larawan 4a).Upang siyasatin kung maaaring baguhin ng DARS-AS1 ang pakikipag-ugnayan ng PACT-PKR, nagsagawa kami ng co-immunoprecipitation (co-IP) assay na may anti-PACT antibody sa SW620 cell lysates.Ang PKR ay lubos na pinayaman sa anti-PACT sa mga control cell, habang ang pagbawi ng PKR ay makabuluhang nabawasan sa mga lysate mula sa mga cell na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1 (Larawan 4b).Ginamit ang purified na may label na PACT at PKR para sa in vitro protein binding assays.Alinsunod dito, ang mga nagbigay ng DARS-AS1 ngunit walang kontrol na RNA ay nagpakita ng pinigilan na pakikipag-ugnayan ng PACT-PKR (Larawan 4c).Ang lahat ng mga resulta ay nagpakita na ang DARS-AS1 ay nakagambala sa komunikasyon ng PACT at PKR.
Ang isang Co-localization ng PACT at PKR sa mga control cell o mga cell na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1 ay naobserbahan gamit ang confocal fluorescence microscopy.Ang nuclei ay nabahiran ng DAPI.Ang mga resulta ng istatistika ay nakuha mula sa 16 na mga larawan.b Co-immunoprecipitation (co-IP) gamit ang anti-PACT antibody sa mga cell lysates ng control SW620 na mga cell o mga cell na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1.c Ang may label na PACT, purified PKR at na-transcribe sa vitro na may DARS-AS1 o mock RNA ay incubated para sa in vitro protein binding analysis.Ang mga anti-flag antibodies ay ginamit para sa immunoprecipitation.Ang mga immunoblots na may ipinahiwatig na mga antibodies ay isinagawa sa SW620 at HCT116 na mga cell na inilipat na may control shRNA o DARS-AS1-shRNA na sinusundan ng serum na gutom.e Binago ng mga antas ng expression ng DARS-AS1 ang cellular sensitivity sa thapsigargin.Ang mga cell ng SW620 ay inilipat gamit ang DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid o control plasmid.Ang mga cell ay ginagamot ng thapsigargin sa loob ng 48 oras at ang cell viability ay natukoy gamit ang MTS reagent.f In vitro transcribe DARS-AS1 o dummy RNA at purified PACT ay ginamit para sa in vitro activation assay at immunoblot detection.Ang mga immunoblots na gumagamit ng mga antibodies na ito ay isinagawa sa SW620-ctrl cells (kaliwa) o mga cell na nag-overexpress ng PKR mutants (kanan).Ang mga cell na ito ay pagkatapos ay inilipat na may control shRNA o DARS-AS1-shRNA na sinusundan ng serum na gutom.h Ang daloy ng cytometry ay nagpakita na ang hindi aktibo ng mutant PKR ay nabayaran para sa DARS-AS1-sapilitan na apoptosis sa mga cell ng SW620.i Ang mga immunoblots na may ipinahiwatig na mga antibodies ay isinagawa sa SW620 (kaliwa) o HCT116 (kanan) na mga cell.Ang mga cell na inilipat na may control shRNA o DARS-AS1 shRNA ay serum-deprived at pupunan ng 100 nM PKR C16 inhibitor o DMSO.Scale bar = 5 µm.Ang data na ipinakita ay ang mean ± standard deviation ng tatlong eksperimento.* p ≤ 0.05 two-tailed Student's t-test.
Karaniwang pinaniniwalaan na kapag nakipag-ugnayan ang PACT sa PKR17, maaaring ma-induce ang PKR phosphorylation sa Thr451.Ang aming mga resulta ay nagpahiwatig na ang antas ng PKR phosphorylation ay makabuluhang nakataas sa DARS-AS1 knockdown cells pagkatapos ng serum starvation (Fig. 4d at Pandagdag na Fig. 4a).Alinsunod dito, nalaman namin na ang phosphorylation ng eIF2α, ang pangunahing substrate ng PKR, ay makabuluhang nadagdagan din ng DARS-AS1 shRNA (Larawan 4d at Karagdagang Fig. 4a).Ang Thapsigargin ay isang ER stressor na nagiging sanhi ng paglabas ng ER ng Ca2+.Ang paggamot na may thapsigargin ay naiulat na mag-udyok sa pagpapahayag at pag-activate ng PACT, na higit na nakikipag-ugnayan at nagpapa-aktibo sa PKR, na humahantong sa apoptosis sa pamamagitan ng pagtaas ng eIF2α phosphorylation 18,61 .Dito, ginamit namin ang thapsigargin bilang isang stimulator ng PACT/PKR pathway upang siyasatin kung ang DARS-AS1 ay makakatulong sa mga cell na malampasan ang stress sa pamamagitan ng pagpigil sa PACT/PKR pathway.Napansin namin na ang antas ng expression ng DARS-AS1 ay positibong nakakaugnay sa paglaban ng cell sa thapsigargin.Ang mga cell ng SW620 na labis na nagpapahayag ng DARS-AS1 ay nakaligtas nang mas mahusay kapag ginagamot sa thapsigargin, habang ang mga cell na may DARS-AS1 knockdown ay naging mas madaling kapitan (Fig. 4e).Alinsunod sa mga resultang ito, ang DARS-AS1 overexpression ay nabawasan ang thapsigargin-induced PKR phosphorylation (Karagdagang Fig. 4b).Sa kaibahan, pagkatapos ng paggamot sa thapsigargin, ang PKR at eIF2α ay phosphorylated sa isang mas mataas na lawak sa DARS-AS1 knockdown cells kumpara sa mga control cell (Karagdagang Fig. 4b).Kapansin-pansin, ang thapsigargin ay nag-udyok sa DARS-AS1 na expression sa isang paraan na umaasa sa dosis, na maaaring magpahiwatig ng isang anti-stress function ng DARS-AS1 (Karagdagang Fig. 4c).Bilang karagdagan, nagsagawa kami ng in vitro activation assays upang kumpirmahin ang mga obserbasyon na ito.Sa madaling sabi, ang PKR ay nalinis mula sa mga cell lysate gamit ang isang anti-PKR antibody, pagkatapos ay na-incubated na may recombinant PACT at DARS-AS1 na na-transcribe sa vitro.Matapos ang reaksyon ng enzymatic, nakita ang phospho-PKR gamit ang WB.Ang aming mga resulta ay nagpahiwatig na ang PKR phosphorylation ay makabuluhang hinarang ng DARS-AS1, ngunit hindi sa pamamagitan ng control RNA (Larawan 4f).Ang mga resultang ito sa vitro at in vivo ay nagmumungkahi na ang DARS-AS1 ay humahadlang sa PACT-mediated PKR activation.Kasabay nito, napansin din namin ang pagbawas sa pagbawi ng PACT sa pagkakaroon ng DARS-AS1 (Larawan 4f).Ang resulta na ito ay naaayon sa mga resulta ng in vitro protein binding assay (Larawan 4c) at muling inilalarawan ang blocking function ng DARS-AS1 para sa PACT-PKR association.
Ser246 at Ser287 sa D3 domain ng PACT ay kinakailangan para sa PKR activation sa ilalim ng cellular stress.Ang pagpapalit ng dalawang serine residue para sa alanine ay nagbigay ng mutant PACT (mutD), na nag-activate ng PKR sa kawalan ng stress, at ang pagpapalit para sa alanine (mutA) ay binaligtad ang protocol.Dahil ipinakita namin ang kahalagahan ng domain na ito sa direktang kaugnayan sa DARS-AS1, nabuo namin ang dalawang PACT mutant na ito upang subukan kung ang mga nalalabi na ito ay maaari ding kasangkot sa pakikipag-ugnayan sa DARS-AS1.Kapansin-pansin, ang parehong mga mutant ay nawalan ng kakayahang magbigkis sa DARS-AS1 (Karagdagang Fig. 4d), na nagmumungkahi na ang kumpletong istraktura ng protina ng PACT ay maaaring kailanganin para sa mahusay na pakikipag-ugnayan sa DARS-AS1.
Higit pa rito, iminumungkahi din ng aming mga resulta na ang DARS-AS1-shRNA-induced inhibition ng cell proliferation ay maaaring bahagyang maibalik sa pamamagitan ng overexpressing isang nangingibabaw na negatibong PACT mutant (PACTmutA) o isang nangingibabaw na negatibong PKR mutant (PKRmut) (Karagdagang Fig. 4e. e).Ang overexpression ng dominant-negative PKR mutants ay nabawasan ang PKR phosphorylation na dulot ng DARS-AS1 knockdown pati na rin ang eIF2α phosphorylation sa serum-deprived cells (Fig. 4g).Higit sa lahat, ang proporsyon ng mga apoptotic na cell na sapilitan ng DARS-AS1 knockdown ay nabawasan din sa mga cell na overexpressing PKRmut (Larawan 4h at Karagdagang Larawan 4g).Ang pagsugpo sa aktibidad ng PKR kinase ay nakakapinsala din sa pag-andar ng DARS-AS1, dahil ang mga resulta ay nagpakita na ang DARS-AS1 knockdown ay bihirang nag-trigger ng PKR at eIF2α phosphorylation kapag ang mga cell ay ginagamot ng isang PKR-specific na C16 inhibitor (Fig. 4i at Pandagdag na Fig. 4h).).Kung sama-sama, iminumungkahi ng aming mga resulta na ang DARS-AS1 ay nagtataguyod ng paglaganap ng cell, hindi bababa sa bahagi, sa pamamagitan ng pagpigil sa PACT-mediated PKR activation.
Upang higit pang galugarin ang papel ng DARS-AS1 sa tumorigenesis, nagsagawa kami ng mga eksperimento sa vivo gamit ang isang modelo ng mouse xenograft. Ipinapakita ng mga resulta na ang pagbagsak ng DARS-AS1 ay kapansin-pansing nabawasan ang paglaki ng tumor sa mga daga (p value <0.0001) (Larawan 5a). Ipinapakita ng mga resulta na ang pagbagsak ng DARS-AS1 ay kapansin-pansing nabawasan ang paglaki ng tumor sa mga daga (p value <0.0001) (Larawan 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Ang mga resulta ay nagpapakita na ang DARS-AS1 knockdown ay lubhang binabawasan ang paglaki ng tumor sa mga daga (p value <0.0001) (Larawan 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Ang mga resulta ay nagpakita na ang DARS-AS1 knockdown ay makabuluhang nabawasan ang paglaki ng tumor sa mga daga (p value <0.0001) (Larawan 5a).Kaya, sa DARS-AS1 knockdown group, mayroong isang makabuluhang pagbaba sa ibig sabihin ng dami ng tumor ng halos 72.9% at ang ibig sabihin ng tumor mass ng halos 87.8% (Larawan 5b-d).Ang mga resulta na ito ay mariing nagmumungkahi na ang DARS-AS1 ay maaaring makabuluhang magsulong ng paglaki ng tumor sa vivo.
Mga epekto ng ad DARS-AS1 knockdown sa colorectal oncogenesis sa mga hubad na daga.Ipinapakita ang mga curve ng paglaki (a), laki ng tumor (b), timbang (c), at mga larawan ng tumor (d).Ang mga error bar ay kumakatawan sa ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, sa pamamagitan ng two-tailed Student's t test. n = 10. ****p < 0.0001, sa pamamagitan ng two-tailed Student's t test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 two-tailed Student's t-test.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 two-tailed Student's t-test.Sinuri ng Kaplan-Meier ang ugnayan sa pagitan ng mga antas ng ekspresyon ng DARS-AS1 at pangkalahatang kaligtasan sa mga pasyente na may UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, at LGG.Ang mataas na antas ng DARS-AS1 expression sa mga pasyente ay nasa nangungunang 50%;ang mababang antas ng DARS-AS1 expression sa mga pasyente ay nasa ilalim ng 50%.natukoy ang mga p-value gamit ang log rank test.f Iminungkahing modelo kung saan kinokontrol ng DARS-AS1 ang landas ng PACT-PKR at paglaki ng tumor.
Upang mas maunawaan ang klinikal na epekto ng DARS-AS1, sinuri namin ang ugnayan sa pagitan ng pagpapahayag nito at kaligtasan ng pasyente.Sa pamamagitan ng pagsusuri sa dataset ng TCGA, nalaman namin na ang mas mataas na expression ng DARS-AS1 ay nauugnay sa uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Ang mas mababang kaligtasan ng buhay ay makabuluhang nauugnay sa glioblastoma morphosis (GBM) at mga pasyente na may mababang antas ng brain glioma (LGG) (Larawan 5e).Ang mga resulta na ito ay nagmumungkahi na ang DARS-AS1 ay maaaring may mahalagang papel sa pag-unlad ng klinikal na tumor at maaaring maging isang potensyal na predictive biomarker sa maraming mga cancer.
Sa pag-aaral na ito, gamit ang malakihang CRISPRi functional screening, natukoy namin na ang DARS-AS1 lncRNA ay nagtagumpay sa cancer cell stress sa pamamagitan ng pag-regulate ng dalawang pangunahing tagatugon sa stress, ang PACT at PKR.Sa pamamagitan ng direktang pakikipag-ugnay sa PACT, hinarang ng DARS-AS1 ang pag-activate ng PKR-mediated ng PACT, sa gayon ay pinipigilan ang apoptotic cell death at nagpo-promote ng paglaganap ng cell (Fig. 5f).Ang upregulation ng DARS-AS1 ay naobserbahan sa maraming uri ng cancer, na nagmumungkahi na ang pagpapaandar nito sa pagtataguyod ng kaligtasan ng selula ng kanser sa ilalim ng mga nakababahalang kondisyon ay maaaring malawak na naaangkop sa maraming uri ng kanser.
Ang PACT ay nakilala bilang isang PKR activator protein, at ang PACT-mediated PKR activation ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa mga tugon sa stress sa pamamagitan ng pag-regulate ng transkripsyon, pagsasalin, apoptosis, at iba pang mahahalagang proseso ng cellular62.Sa loob ng mga dekada, ginawa ang mga pagtatangka upang maunawaan ang regulasyong partikular sa kanser ng PACT-PKR cascade.Dito, ang aming pag-aaral ay nagsiwalat ng ibang mekanismo ng regulasyon ng PACT-PKR sa mga selula ng kanser sa pamamagitan ng cellular lncRNA DARS-AS1, na direktang nagbubuklod sa PACT, hinaharangan ang pakikipag-ugnayan ng PACT-PKR, pinipigilan ang pag-activate ng PKR at eIF2α phosphorylation, sa gayon ay pinipigilan ang apoptosis na sanhi ng stress at pinasisigla ang paglaganap ng kanser sa wakas.mga selula.Ang pagtuklas na ito ay nagbibigay liwanag sa mga potensyal na target ng lncRNA para sa pagbabala at therapy ng kanser.
Ipinakita ng aming data na ang DARS-AS1 knockdown ay nagpaparamdam ng mga cell sa serum na gutom na may makabuluhang pagtaas sa phosphorylated PKR at eIF2α.Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang DARS-AS1 ay nagtataguyod ng kaligtasan ng selula ng kanser sa ilalim ng malupit na mga kondisyon sa pamamagitan ng pagpigil sa aktibidad ng PACT/PKR.Maraming iba pang mga non-coding na RNA, tulad ng ASPACT at nc886, ay kasangkot din sa PACT/PKR axis sa pamamagitan ng pag-downregulate ng PACT48 mRNA o pag-regulate ng autophosphorylation sa pamamagitan ng pagbubuklod sa PKR49,50,64.Kabilang sa mga ito, ang DARS-AS1 ay kumikilos bilang isang disruptor ng PACT-PKR association.Ang pag-aaral na ito ay nagpapayaman sa aming pag-unawa sa regulasyon ng axis ng PACT/PKR at ang papel ng mga lncRNA sa mga tugon sa stress.
Ang PACT ay naglalaman ng tatlong magkakahiwalay na domain.Ang bawat isa sa unang dalawang dsRBD ay sapat upang makamit ang mataas na pagkakaugnay ng PACT sa PKR, habang ang ikatlong domain (D3) ay kinakailangan para sa PKR activation in vitro at in vivo.Ipinakita ng aming pag-aaral na ang DARS-AS1 ay mas gustong makipag-ugnayan sa D3 domain (Larawan 3h).Dahil sa malaking sukat ng lncRNA (768 nucleotides), ang DARS-AS1 na nagbubuklod sa D3 ay maaaring pisikal na pigilan ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng domain ng PACT ng dsRBD at PKR, at sa gayon ay hinaharangan ang samahan ng PACT at PKR.Ang mga mutasyon ng PACT point na pinalitan ang Ser246 at Ser287 sa D3 ng alanine o aspartate ay nakagambala sa pagkakaugnay nito para sa DARS-AS1, na nagtuturo sa kahalagahan ng pangkalahatang istruktura at elektrikal na katangian ng D3 sa kanilang samahan.Higit pang mga detalye ng mekanismong ito ay kakailanganin sa hinaharap, gamit ang mas tumpak na pagsusuri ng biochemical at mataas na resolusyon na pagsusuri sa istruktura ng PACT.
Iniulat ng mga nakaraang pag-aaral na ang DARS-AS1 ay nagtataguyod ng paglaganap ng cell sa pamamagitan ng ilang mga mekanismo 51, 52, 53.Sa isang halimbawa, napagmasdan ng mga investigator na pinataas ng DARS-AS1 ang antisense protein-encoding na DARS gene nito sa pamamagitan ng pag-target sa miP-194-5p sa mga selula ng kanser sa bato.Gayunpaman, sa kasalukuyang pag-aaral, ang DARS-AS1 knockdown ay may kaunting epekto sa transkripsyon ng DARS sa maraming uri ng kanser, kabilang ang hindi bababa sa colorectal, suso, at mga kanser sa atay.Dahil ang mga lncRNA ay nagpapakita ng mga pattern ng expression na tukoy sa cell at tissue, ang mga functional na mekanismo ay maaaring hindi mapangalagaan sa mga uri ng cancer, na maaaring mag-ambag sa pagkakaibang ito sa pagitan ng aming mga obserbasyon at mga nakaraang pagtatasa ng iba't ibang mga kanser.Ang mga espesyal na pag-aaral ay kinakailangan upang ipaliwanag ang mga tiyak na mekanismo ng iba't ibang mga proseso ng physiological at pathological.
Ang isang pagsusuri ng klinikal na data ay nagpakita na ang DARS-AS1 expression sa mga tumor ay inversely correlated sa kaligtasan ng mga pasyente ng cancer, na binibigyang-diin ang kahalagahan ng DARS-AS1/PACT/PKR axis sa cancer prognosis.Sa konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang DARS-AS1 ay isang regulator ng PACT/PKR signaling axis, nagtataguyod ng paglaganap ng cancer cell, at pinipigilan ang apoptosis sa panahon ng pagtugon sa stress, na nagbibigay ng isa pang linya ng pananaliksik at interesado para sa hinaharap na pananaliksik sa mga potensyal na paggamot. .
Ang mga linya ng human cell na SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 at HEK293T ay nakuha mula sa National Cell Line Resource Infrastructure sa China.Ang lahat ng mga cell ay pinananatili sa DMEM medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) na pupunan ng 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) at 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) sa 37°C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normal na mouse IgG, CST (5415S);normal na kuneho IgG, CST (2729S).Ang mga antibodies ay natunaw ng 1:1000 sa PBST para sa Western blotting at 1:100 para sa IP.
Ang mga sgRNA ay binuo gamit ang isang pampublikong magagamit na tool na tinatawag na CRISPR-ERA66.Ginamit namin ang mga default na parameter ng tool para sa pagbuo ng sgRNA at ang algorithm ay nakalkula ang mga site na nagbubuklod ng sgRNA sa 3 kb na rehiyon.nakasentro sa TSS.Ang mga pool ng sgRNA oligonucleotides ay na-synthesize sa CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) at na-clone sa humanized pgRNA plasmids (Addgene #44248).Isang kabuuan ng 12 μg ng pooled humanized pgRNA plasmid, 7.2 μg ng psPAX2 (Addgene #12260), at 4.8 μg ng pMD2.G (Addgene #12259) ay co-transfected sa 5 x 106 HEK293T dishes gamit ang DNAagent Transfection sa 10 cells ( CWBIO, Beijing, China) na sumusunod sa mga tagubilin ng tagagawa.Ang mga supernatant na naglalaman ng virus ay nakolekta 48 at 72 na oras pagkatapos ng paglipat at na-filter sa pamamagitan ng isang 0.45 μm na filter.Para sa screening, ang mga cell ng SW620 na nagpapahayag ng dCas9/KRAB fusion protein ay nakuha ng virus transduction.Ang binagong SW620 cells ay nahawahan ng virus library sa apat na independiyenteng mga eksperimento sa impeksyon sa isang MOI na 0.1-0.3 at na-sample ng 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) sa loob ng 2 araw.Pagkatapos nito, ang mga cell ay nilinang para sa 18 araw sa vitro na may isang minimum na saklaw ng library na 500 mga cell / sgRNA para sa screening.
Ang genomic DNA ay nakuha ayon sa mga tagubilin ng QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183).Sa kabuuan, 100 μg ng genomic DNA bawat biological na pag-uulit ang ginamit upang maitayo ang aklatan.Ang rehiyon ng sgRNA ay pinalaki ng dalawang round ng PCR at naka-link sa isang barcode.
Ang mga produkto ng PCR ay dinalisay gamit ang NucleoSpin® gel at PCR purification kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) at binibilang gamit ang Qubit™ HS double-stranded DNA detection kit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ang MTS assay ay ginamit upang masukat ang paglaganap ng cell.Ang mga cell ay na-seeded sa 96-well plate sa paunang density ng 2000 cells/well.Ang kamag-anak na bilang ng mga cell ay sinusukat araw-araw sa ipinahiwatig na oras para sa kabuuang 4-6 na araw.Para sa bawat balon, 20 μl ng MTS reagent (Promega) ay natunaw ng 100 μl ng DMEM, na natupok ng mga cell nang 4 h sa 37 ° C, at pagkatapos ay sinusukat ang OD490.
Natuklasan ang kapasidad para sa hindi naka-chord na paglago sa pamamagitan ng pagsusuri sa pagbuo ng mga sphere.Sa madaling sabi, 2000 mga cell na inilipat gamit ang shRNA DARS-AS1 o control shRNA ay nilinang sa mga ultra low attachment microplates (Corning) na may katamtamang pagbabago tuwing 4 na araw.Ang mga spheroid ay binibilang pagkatapos ng 14 na araw.500 mga cell na inilipat gamit ang DARS-AS1 overexpression plasmid o isang control plasmid ay ginamit para sa pagpapahusay na assay, kung hindi man ang pamamaraan ay hindi nabago.
Ang RNA ay na-transcribe gamit ang T7 RNA polymerase at biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ayon sa mga tagubilin ng Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Ang mga panimulang aklat na ginamit dito ay nakalista sa Karagdagang Talahanayan 4.
Ang mga rehiyon ng protina-coding PACT o PKR ay na-clone sa pET15b (Addgene #73619) at binago sa BL21 (DE3).Ang bakterya ay incubated magdamag sa LB na binigay ng ampicillin at pagkatapos ay diluted 100-fold na may sariwang LB.Kapag ang OD600 ng daluyan ay umabot sa 0.8, idinagdag ang 1 mM IPTG upang mapukaw ang pagpapahayag ng protina.Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog magdamag na may banayad na pag-alog (250 rpm sa 20 ° C), ang cell pellet ay nakolekta sa pamamagitan ng centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).I-resuspend ang cell pellet sa lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) at i-incubate sa yelo sa loob ng 30 min, pagkatapos ay sonicate (15 min, 5 s on/off, on ice) at centrifuge (13,000). rpm)., 30 min, 4°C).Ang supernatant ay pagkatapos ay na-load sa Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 beses sa 4 ° C, hugasan ng 4 na beses na may wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) at eluted 3 beses, na may kabuuang ng 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Ang purified protein ay natukoy gamit ang WB at ang konsentrasyon ay natukoy gamit ang Qubit™ protein assay kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Ang mga assay ng RIP ay isinagawa tulad ng naunang inilarawan, na may mga pagbabago.Sa madaling sabi, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) at centrifuge sa 13,000 rpm sa loob ng 15 min sa 4 °C.Ang supernatant ay pagkatapos ay incubated na may protina A + G magnetic beads (Millipore) conjugated na may 5 μg ng anti-PACT antibody (Abeam) o IgG (CST).Ang mga kuwintas ay hugasan ng 5 beses na may 5x RIP buffer, pagkatapos ay hinukay na may proteinase K (NEB).Ang RNA ay nakuha kasama ng Trizol at tinutukoy ng RT-qPCR.Ang mga panimulang aklat ay ipinakita sa Karagdagang Talahanayan 5.
Ang in vitro RIP assay ay isinagawa ayon sa isang binagong standard RIP assay protocol.Isang kabuuan ng 5 pmol ng in vitro na na-transcribe na RNA ay natunaw ng 1x na may RIP buffer at na-annealed sa pamamagitan ng pagpapapisa ng itlog sa 65 ° C sa loob ng 5 minuto na sinusundan ng mabagal na paglamig sa temperatura ng silid.Isang kabuuan ng 5 pmol ng buo o mutated na flag-label na PACT na mga protina ay nalinis mula sa E. coli.I-incubate gamit ang renatured RNA sa loob ng 2 oras sa 4°C at sundin ang pamamaraan sa itaas para sa pagsusuri ng RIP para sa anti-flag IP.
Para sa pagsusuri ng extension ng RNA, ang 1 × 107 na mga cell ay na-lysed na may 1xRIP buffer.Pagkatapos ng centrifugation sa 13,000 rpm para sa 15 min sa 4 ° C, ang supernatant ay pretreated na may 30 μl ng streptavidin magnetic beads (Beckman) sa loob ng 2 h sa 4 ° C.Ang purified lysate ay binigyan ng yeast tRNA at incubated na may 40 pmol ng renatured RNA magdamag sa 4 ° C, pagkatapos ay para sa isa pang 2 oras at 20 μl ng bagong streptavidin magnetic beads na hinarangan ng BSA ay idinagdag.Ang hakbang sa paghuhugas ay binubuo ng 4 na beses na may 5x RIP buffer at 4 na beses na may 1x RIP buffer.Ang kaukulang mga protina ay pinahiran ng biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) at pinaghiwalay sa NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Pagkatapos ng paglamlam ng pilak (Beyotime Biotechnology), ang ilang mga banda ay inalis at sinuri ng MS.
Ang pagsusuri ng Co-IP ay isinagawa upang subukan ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng PACT at PKR.Sa madaling sabi, ang mga supernatant lysate ay inihanda sa pamamagitan ng pagpapapisa ng 1 x 107 lysed cells sa 1 x RIP buffer na sinusundan ng centrifugation sa 13,000 rpm sa loob ng 15 minuto sa 4 ° C.Ang mga lysate ay puno ng protina A + G magnetic beads, pinagsama ng 5 µg ng anti-PACT antibody, at malumanay na pinaikot magdamag sa 4°C.Ang mga kuwintas ay hugasan ng 3 beses gamit ang 5 × RIP buffer, dalawang beses na may 1 × RIP buffer at pinahiran ng 1 × SDS buffer.Ang nakuhang protina ay nasuri ng SDS-PAGE gel at nakita ng WB.
Dalawang pmol ng naka-flag na PACT at 1 pmol ng PKR ay nalinis mula sa E. coli.Dilute sa 1× RIP buffer at i-incubate gamit ang 10 pmol ng renatured RNA sa loob ng 2 oras sa 4 °C.Pagkatapos nito, na-incubate sila ng protina A+G magnetic bead-conjugated anti-labeled antibody para sa karagdagang dalawang oras.Ang mga kuwintas ay pagkatapos ay hugasan ng apat na beses na may 1x RIP buffer at eluted na may 1x SDS buffer.Ang resultang PACT at PKR ay nakita ng WB.